王瑞琦，郭玉杰，沈青山，劉云鶴，劉濟(jì)千，張志強(qiáng)，張春暉

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021）（2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）（3.新疆泰昆集團(tuán)股份有限公司，新疆昌吉 831100）（4.山東海鈺生物技術(shù)股份有限公司，山東濟(jì)寧 272000）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）又稱退行性骨關(guān)節(jié)病，是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病[1]。目前臨床上對骨關(guān)節(jié)炎的治療還未找到較好的方法，大多通過非甾體藥物來減輕疼痛，延緩病情發(fā)展，改善患者生活質(zhì)量。硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）作為改變骨關(guān)節(jié)炎癥狀的慢作用藥物，對慢性骨關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果[2]。在歐洲、美國等發(fā)達(dá)國家，已作為藥品和膳食補(bǔ)充劑的重要原料用于減少骨關(guān)節(jié)患者疼痛、改善關(guān)節(jié)功能[3]。除硫酸軟骨素外，骨膠原蛋白肽也能起到緩解骨關(guān)節(jié)炎的作用。Fanny[4]等研究發(fā)現(xiàn)骨膠原蛋白肽不僅能增加機(jī)體骨骼的穩(wěn)定性和堅(jiān)固性，還能刺激機(jī)體軟骨細(xì)胞合成II型膠原蛋白，緩解骨關(guān)節(jié)炎癥。一些以II型膠原蛋白為主的軟骨組織經(jīng)酶解制備的軟骨膠原蛋白肽能使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，能有效地抑制關(guān)節(jié)組織內(nèi)部的自身免疫反應(yīng)，對骨關(guān)節(jié)炎有明顯的防治功效[5]。動物的軟骨組織中富含膠原蛋白、硫酸軟骨素和礦物質(zhì)元素等生物活性物質(zhì)[6]。這些活性成分對關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等退行性骨關(guān)節(jié)疾病具有潛在改善和治療作用，是制備骨健康類功能食品的重要原料。

我國肉雞產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，2019年雞肉產(chǎn)量高達(dá) 1380萬t，位居世界第二[7]。肉雞在加工過程中產(chǎn)生大量的骨副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物并沒有被合理利用，大多被當(dāng)作廢棄物直接丟棄或用于飼料生產(chǎn)，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，雞骨副產(chǎn)物的高值化加工利用意義重大。雞胸軟骨作為肉雞加工的主要副產(chǎn)品之一，其水解物對大鼠骨關(guān)節(jié)炎具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用[8]，但是軟骨水解物中包含了骨多肽、骨多糖和硫酸軟骨素等組分，具體哪些功能物質(zhì)發(fā)揮了主要抗炎活性尚無明確定論。

本研究以雞胸軟骨為原料，通過制備雞胸軟骨水解物、雞胸軟骨膠原蛋白肽和硫酸軟骨素對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。并以碘乙酸鈉誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠為動物模型，通過斜板實(shí)驗(yàn)探究了雞胸軟骨水解物對大鼠關(guān)節(jié)炎的緩解作用。并通過對關(guān)節(jié)炎大鼠中三種主要炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGE-2的分泌影響，進(jìn)一步分析雞胸軟骨水解物中II型膠原蛋白肽和硫酸軟骨素在抗炎活性中發(fā)揮的作用，明確雞胸軟骨水解物中抗炎活性成分，為抗骨關(guān)節(jié)炎活性功能性食品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸軟骨，來自 42日齡成年白羽雞，由河南PROTIL生物技術(shù)有限公司提供，將剔除肉和筋膜的雞胸軟骨保存于-20 ℃冰箱備用。硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸軟骨素ABC酶（50~250 U/mg），美國Sigma公司。硫酸皮膚素和肝素，美國 Medchem公司。木瓜蛋白酶（800 U/mg）和胰蛋白酶（1:250），北京Solarbio科技有限公司。軟骨類不飽和二糖標(biāo)準(zhǔn)品ΔDi0 S （ ΔUA-[1→3]-GalNAc）， ΔDi4 S（ ΔUA-[1→3]-GalNAc-4 S ） ， ΔDi6 S（ΔUA-[1→3]-GalNAc-6 S），ΔDi2,4 diS（ΔDi-dis B,ΔUA-2 S-[1→3]-GalNAc-4 S），ΔDi2,6 diS（ΔDi-dis D,ΔUA-2 S-[1→3]-GalNAc-6 S），ΔDi4,6 diS（ΔDidis,ΔUA-4 S-[1→3]-GalNAc-6 S），ΔDi2,4,6 triS（ΔDi tris,ΔUA-2 S-[1→3]-GalNAc-4 S,6 S），英國Iduron公司。IL-1βElisa試劑盒、TNF-αElisa試劑盒、PGE-2 Elisa試劑盒，南京建成生物有限公司。

實(shí)驗(yàn)動物：47只SD健康雄性大鼠（許可證號：SYXK(京)2018-0033），由北京福納康生物技術(shù)有限公司提供，5~6周齡，體重125 g~150 g，按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度22 ℃~25 ℃，濕度為50%~60%，光照為每12 h晝夜交替，飲用純凈水，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本文研究所做動物實(shí)驗(yàn)均獲得倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100氨基酸分析儀，美國安捷倫公司。TENSOR27傅立葉紅外光譜儀，瑞士 Bruker公司。ICS-300高效液相色譜儀，美國戴安公司。FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。MOS-450圓二色光譜儀，法國Biologic公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞胸軟骨水解物活性成分的制備

軟骨解凍后放入燒杯中，燒杯中加入蒸餾水，軟骨與蒸餾水的固液比為1:2.5（W/V）。在120 ℃（0.1MPa）條件下熱壓處理90 min。將熱壓后的軟骨液化液在1200 r/min條件下勻質(zhì)20 s，并用六層紗布進(jìn)行過濾除去殘?jiān)Ｏ驗(yàn)V液中加入蒸餾水，調(diào)節(jié)可溶性固形物含量至2.0，加入胰蛋白酶（0.13%），60 ℃條件下酶解2 h。加入木瓜蛋白酶（0.1%），60 ℃條件下繼續(xù)酶解2 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水加熱5 min，進(jìn)行滅酶處理。將酶解后的軟骨液化液用離心機(jī)離心，取上層清夜。將離心后的上層清液放入冷凍干燥機(jī)中，凍干后的樣品即為軟骨水解物樣品。

參照沈青山[9]等的方法，將酶解后的上層清液用0.45 μm的微濾膜進(jìn)行過濾，得到第一截留物和第一濾液，將第一濾液加入等量蒸餾水，在10 ku的超濾膜條件下，進(jìn)行六次循環(huán)過濾，蠕動泵轉(zhuǎn)速設(shè)置為100 r/min，得到第二截留物和第二濾液。將第一截留物與第二濾液進(jìn)行合并后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，即為膠原蛋白肽樣品。將第二截留物用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥即為硫酸軟骨素樣品。

1.3.2 提取率計(jì)算

膠原蛋白肽提取率=凍干所得的膠原蛋白肽質(zhì)量/雞胸軟骨質(zhì)量(干重)×100%

硫酸軟骨素提取率=凍干所得的硫酸軟骨素質(zhì)量/雞胸軟骨質(zhì)量(干重)×100%

1.3.3 掃描電鏡

將軟骨水解物，膠原蛋白肽和硫酸軟骨素樣品在2.5%戊二醛中室溫下固定4 h，再用1%鋨酸固定2 h，蒸餾水除去鋨酸。用乙醇進(jìn)行分級脫水（30%~100%），樣品用臨界點(diǎn)進(jìn)行干燥。將所有樣品固定在鋁制短管上，涂上金。在10 kV加速電壓下觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)為 150×和 2000×[10]。

1.3.4 傅里葉紅外光譜

將軟骨水解物、膠原蛋白肽、硫酸軟骨素樣品與硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品分別與KBr固體（1:200）充分混勻研磨后，進(jìn)行壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀，在4000~400 cm-1范圍內(nèi)，分辨率為4 cm-1，頻率為16次條件下進(jìn)行掃描[11]。

1.3.5 氨基酸分析

分別稱取100 mg軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品，溶于10 mL的6 mol/L HCl中，充氮?dú)? min，微沸狀態(tài)時(shí)密封，110 ℃水解24 h，加入5 mL 10 mol/L NaOH進(jìn)行中和，定容后用雙層濾紙過濾，15000 r/min條件下離心 10 min后取上清液于氨基酸自動分析儀分析[12]。

1.3.6 肽分子量分布

參考葉燕軍[13]等的方法，用安捷倫液相色譜儀（安捷倫 HPLC1260-II）測定軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品的肽分子量分布，色譜柱 TSK gel G2000 SWXL（7.8×300 mm，TOSOH，Tokyo，Japan），在214 nm處檢測。流動相為乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1，V/V/V），流速為0.5 mL/min。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。以細(xì)胞色素C（12384 u）、抑肽酶（6495 u）、桿菌肽（1421 u）、四肽（451 u）和二肽（146 u）為標(biāo)準(zhǔn)品，分子量校準(zhǔn)曲線（y=-3.904x+27.693，R2=0.9832）。

1.3.7 膠原蛋白肽樣品紫外光譜與圓二色性分析

將膠原蛋白肽樣品溶于0.05 mol/L醋酸（HAc）溶液中，配制成濃度為 0.3 mg/mL的溶液。以 0.05 mol/L的HAc溶液作為空白，在190~500 nm波長下進(jìn)行紫外光譜檢測[14]。

將膠原蛋白肽樣品溶于0.05 mol/L醋酸（HAc）溶液，配成濃度為0.3 mg/mL的溶液，在190~250 nm波長下平均掃描3次[15]。

1.3.8 硫酸軟骨素樣品瓊脂糖凝膠電泳

參考Volpi N[16]等的方法，對所提硫酸軟骨素樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。首先配制硫酸軟骨素ABC酶緩沖液（33 mM Tris-HCl、pH=6.2、33 mM醋酸鈉和1 mU軟骨素ABC酶），保存?zhèn)溆?。將硫酸軟骨素樣品，硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品，硫酸皮膚素和肝素溶于硫酸軟骨素ABC酶緩沖液中，配置為5 mg/mL的樣品，在37 ℃下酶解12 h。將20 μL硫酸軟骨素ABC酶處理前后的硫酸軟骨素樣品，硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品，硫酸皮膚素和肝素進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后在0.1%十六烷基三甲基溴化銨溶液中浸泡6 h后用甲苯胺藍(lán)染色6 h。背景用蒸餾水淡去后進(jìn)行觀察分析。

1.3.9 二糖組成分析及蛋白含量測定

參考Maccri F[17]等的方法，將提取的硫酸軟骨素樣品加入硫酸軟骨素 ABC酶緩沖液中，配置為 5 mg/mL的樣品，37 ℃條件下酶解 12 h，酶解后在100 ℃條件下5 min使酶失活，冷卻至室溫后13000 r/min離心20 min，取上清液，冷凍備用。酶解后樣品采用HPLC法進(jìn)行二糖組成分析，色譜柱為Ultimate SAX型色譜柱；檢測波長為232 nm；柱溫為40 ℃；流速為0.75 mL/min；流動相A為1 M的氯化鈉（pH 4），流動相B為50 mM（pH 4），洗脫程序在0~5 min，A保持0%；在5~35 min，進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣量為10 μL，用標(biāo)準(zhǔn)雙糖進(jìn)行定性定量分析。

采用Lowry法對硫酸軟骨素樣品中蛋白含量進(jìn)行測定[18]。

1.3.10 雞胸軟骨活性成分的抗炎活性試驗(yàn)

將SD大鼠隨機(jī)分為正常組（7只）和關(guān)節(jié)炎組（40只）。動物造模采用碘乙酸鈉誘導(dǎo)，以觀察到大鼠關(guān)節(jié)腫脹為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，最終判定建模成功 35只，將35只建模成功的骨關(guān)節(jié)炎大鼠隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組7只，具體分組及飼料配置如下：模型組，以灌胃方式給予生理鹽水。陽性對照組，灌胃雙醋瑞因膠囊8.0 mg/(kg·d)。軟骨水解物處理組，灌胃軟骨水解物劑量為500 mg/(kg·d)。膠原蛋白肽處理組，灌胃膠原蛋白肽劑量為365 mg/(kg·d)。硫酸軟骨素處理組，灌胃硫酸軟骨素劑量為100 mg/(kg·d)。從建模成功后第1 d開始連續(xù)給藥28 d，每日1次，上述藥品溶于生理鹽水中進(jìn)行灌胃。模型組和空白對照組通過灌胃給予相同體積的生理鹽水，同樣連續(xù)28 d，每日1次。

（1）斜板實(shí)驗(yàn)：在建模后灌胃第0 d（灌胃前1 d）、7 d、14 d、21 d、28 d，每組取5只大鼠置于25 °斜面上適應(yīng) 1 min，之后逐漸增加斜板的角度。當(dāng)大鼠可在一定角度堅(jiān)持5 s且不滑落，則繼續(xù)增加角度，直至無法在該斜板上堅(jiān)持5 s。記錄大鼠所能堅(jiān)持的最大角度。每只測量3次，取平均值。

（2）在第28 d，將各組大鼠麻醉后摘眼球取血，靜置1 h后在4 ℃，3500 r/min條件下離心15 min。取上清液按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行血清中IL-1β、TNF-α、PGE-2的含量測定。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)設(shè) 3個(gè)平行，用Origin 8.0軟件對分析數(shù)據(jù)作圖，采用SPSS 19.0軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白肽和硫酸軟骨素的得率

干燥軟骨的主要成分是蛋白質(zhì)（71.74%）和碳水化合物（21.70%），其次為脂肪（0.24%）和灰分（6.32%），表明雞胸軟骨可用于分離膠原蛋白肽和硫酸軟骨素。取50 g雞胸軟骨（以干重計(jì)），提取可得膠原蛋白肽34.28 g（以干重計(jì)），硫酸軟骨素9.41 g（以干重計(jì)）。經(jīng)計(jì)算，雞胸軟骨膠原蛋白肽的提取率為68.32%（以干重計(jì)）。硫酸軟骨素的得率為18.82%（以干重計(jì)）。

2.2 雞胸軟骨水解物的表征分析

2.2.1 微觀結(jié)構(gòu)觀察

通過掃描電鏡對軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素樣品微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示，凍干后的軟骨水解物樣品為小片鱗片狀，大小不均勻，表面光滑。膠原蛋白肽樣品呈棒狀分布，大小均勻，表面有凸起。硫酸軟骨素樣品呈薄片樹葉狀分布，大小均勻，表面不光滑。該結(jié)果與Zhou[19]等、Barkat[20]等研究結(jié)果一致。

圖1 掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope diagram

2.2.2 傅里葉紅外光譜

由圖2可知，軟骨水解物樣品中特征吸收帶酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶都能被檢測到。根據(jù) Muyonga[21]報(bào)道，酰胺 A帶與N-H伸縮振動和氫鍵有關(guān)，軟骨水解物樣品的酰胺A帶位于3363 cm-1波長處，表明N-H基團(tuán)參與了氫鍵形成。酰胺B帶位于2980 cm-1波長處，這是由于-CH2伸縮振動產(chǎn)生的。酰胺I帶位于1658波長處，這是由于C=O鍵的伸縮振動引起的。酰胺II帶位于1554cm-1波長處，這是由于N-H鍵的彎曲振動和C-H鍵的伸縮振動引起的。酰胺III帶位于1253 cm-1波長處，通常由N-H彎曲振動和C=N伸縮振動有關(guān)[22]。與硫酸軟骨素樣品的紅外圖譜相比，軟骨水解物圖譜在1658 cm-1和1554 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰[23]，它們分別歸屬于酰胺I帶和酰胺II帶。

由圖2可以看出，試驗(yàn)中所制得的硫酸軟骨素樣品與硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖基本一致。硫酸軟骨素樣品和硫酸軟骨素 A標(biāo)準(zhǔn)品分別在 3350 cm-1和3371 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)較寬的吸收峰，表明組分中含有硫酸軟骨素的羥基結(jié)構(gòu)[24]。在2930 cm-1附近出現(xiàn)較弱的吸收峰，這與CH2或CH3的C-H伸縮振動有關(guān)。在1550 cm-1處的特征吸收峰表明樣品中有羰基（-C=O-）和N-H鍵的存在，表明各組分中存在乙酰氨基結(jié)構(gòu)。在1251 cm-1和1045 cm-1處的產(chǎn)生的吸收峰是由于S-O和-C-O-S的伸縮振動產(chǎn)生的。以上光譜特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致，周斯儀[25]等報(bào)道指出，A型CS（CSA）的硫酸基在C4位，產(chǎn)生的軸向伸縮振動峰在850 cm-1附近。王俊[24]等報(bào)道指出，850 cm-1的峰可以被認(rèn)為軟骨素-4-硫酸鹽，820 cm-1的峰值表示軟骨素-6-硫酸鹽。本試驗(yàn)中硫酸軟骨素樣品的峰值在852 cm-1和827 cm-1處，表明樣品主要由硫酸軟骨素A組成。

圖2 傅里葉紅外光譜圖Fig.2 Fourier infrared spectrum

2.2.3 氨基酸分析

通過氨基酸分析儀對軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，軟骨水解物樣品氨基酸含量與膠原蛋白肽樣品差異性顯著（p<0.05），且明顯低于膠原蛋白肽樣品。軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品中氨基酸含量較高的為甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp），其中膠原蛋白肽樣品中甘氨酸含量最高，可達(dá)14.05 mg/g，其次為谷氨酸9.09 mg/g和脯氨酸7.44 mg/g。

表1 軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of cartilage hydrolysates and collagen peptide samples

2.2.4 肽分子量分布

利用高效液相色譜測得軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品的肽分子量分布。由表2可知，軟骨水解物與膠原蛋白肽樣品中肽分子量分布差異性顯著，兩種樣品中肽分子量分布大多集中于1000 u以下，其中膠原蛋白肽樣品中肽分子量在1000 u以下的占了92.38%，500 u以下的占73.85%，表明膠原蛋白肽樣品中主要為小分子肽。張江濤[26]等研究發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量的大小，直接決定肽的吸收速率，分子量1000 u以下的肽轉(zhuǎn)運(yùn)吸收存在獨(dú)立的系統(tǒng)以及相應(yīng)的載體，各種肽之間轉(zhuǎn)運(yùn)無競爭性與抑制性等特點(diǎn)。因此，這種寡肽具有很大的潛力作為生物活性肽使用。

表2 軟骨水解物和膠原蛋白肽樣品的肽分子量含量Table 2 Peptide content of cartilage hydrolysates and collagen peptide samples

2.2.5 膠原蛋白肽樣品紫外光譜和圓二色光譜

膠原蛋白肽樣品的紫外吸收光譜圖顯示其在 230 nm處有一個(gè)較高的吸收峰，這與肽鏈中含有羰基C=O、羧基COOH、酰胺基CONH2等發(fā)色基團(tuán)有關(guān)[27]。有研究表明，波長在 185~245 nm稱為遠(yuǎn)紫外區(qū)，245~320 nm稱為近紫外區(qū)。遠(yuǎn)紫外區(qū)為蛋白質(zhì)肽鏈的吸收峰，反映了主鏈的構(gòu)象[28]。膠原蛋白肽樣品的圓二色譜圖顯示其在197 nm處存在一個(gè)負(fù)峰，在223 nm處存在一個(gè)正峰，表明所提取的樣品符合膠原蛋白肽的典型特征。

圖3 膠原蛋白肽樣品紫外光譜和圓二色光譜Fig.3 UV spectra and CD spectraof collagen peptide samples

2.2.6 硫酸軟骨素樣品瓊脂糖凝膠電泳、二糖組成分析及蛋白含量測定

對提取的硫酸軟骨素樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，圖4為硫酸皮膚素、肝素、硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸軟骨素樣品及其相對應(yīng)的硫酸軟骨素 ABC酶酶解產(chǎn)物的電泳圖。由圖可知硫酸軟骨素 ABC酶可以水解硫酸軟骨素樣品，硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸皮膚素，但不能水解肝素。硫酸軟骨素樣品與硫酸軟骨素A標(biāo)準(zhǔn)品遷移速率大致相同，且遷移速率大于硫酸皮膚素和肝素，初步說明試驗(yàn)所得樣品為硫酸軟骨素。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose-gel electrophoresis

表4 各組大鼠斜板支持角度Table 4 Support angle of oblique plates in each group

通過高效液相色譜法對硫酸軟骨素樣品中二糖組成進(jìn)行測定，圖5為二糖標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸軟骨素樣品的高效液相色譜圖。由表3可知，硫酸軟骨素樣品主要由單硫酸基二糖 ΔDi4s和 ΔDi6s構(gòu)成，非磺化二糖ΔDi0s含量為5.80%，二硫酸基二糖ΔDi4,6dis的含量為0.69%，其他二硫酸基二糖ΔDi2,6dis和ΔDi2,4dis和三硫酸基二糖ΔDi2,4,6tris含量極微，低于0.01%。樣品中4s/6s值為4.03，這與傅里葉紅外光譜結(jié)果一致，表明樣品主要由硫酸軟骨素A組成。這與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，周斯儀[24]等研究表明，F(xiàn)4組分中不含ΔUA2s，且主要的二糖單位為ΔDi4s，表明組分F4主要為硫酸軟骨素A。通過Lowery法獲得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0004x+0.0624，R2=0.9915。經(jīng)計(jì)算得到硫酸軟骨素樣品中蛋白含量為8.13%，表明硫酸軟骨素樣品的相對純度為91.87%。

圖5 二糖標(biāo)準(zhǔn)品和硫酸軟骨素樣品的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of disaccharide standard and chondroitin sulfate sample

表3 硫酸軟骨素樣品的二糖組成及蛋白含量Table 3 Composition and protein content of disaccharide in chondroitin sulfate sample

2.3 雞胸軟骨水解物的抗炎活性研究

2.3.1 斜板實(shí)驗(yàn)

與正常組大鼠斜板支持角度53.8 °相比，造模后各組大鼠的斜板支持角度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。使用雞胸軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素進(jìn)行干預(yù)后，大鼠斜板支持角度逐漸增大。表明使用雞胸軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素可增加大鼠斜板支撐角度，減輕大鼠的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。Sun Y[33]等研究發(fā)現(xiàn)使用鱘魚骨硫酸軟骨素對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的下肢力量恢復(fù)有一定的治療效果。在第28 d，雞胸軟骨水解物組大鼠斜板支持角度為49.0 °，明顯大于膠原蛋白肽組45.8 °和硫酸軟骨素組47.3 °，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。硫酸軟骨素組大鼠支持角度為47.3 °顯著大于膠原蛋白肽組45.8 °，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。這一結(jié)果表明，雞胸軟骨水解物中膠原蛋白肽與硫酸軟骨素聯(lián)用可能具有更好的抗炎效果，且雞胸軟骨水解物中硫酸軟骨素對碘乙酸鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥具有較好的緩解作用。

2.3.2 大鼠TNF-α、IL-1β、PGE-2水平的比較

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TNF-α和IL-1β在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，TNF-α和IL-1β和其他炎癥因子有協(xié)同作用，可以抑制軟骨細(xì)胞II型膠原的形成[29]。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能夠促使T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，與關(guān)節(jié)炎和滑膜細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[30]。IL-1β是一種重要的細(xì)胞因子，與滑膜炎和介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨破壞有關(guān)。PGE-2是細(xì)胞生長的重要調(diào)節(jié)因子，也是滑膜和關(guān)節(jié)疼痛的直接原因之一[31]。如表5所示，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、PGE-2水平分別為39.90 pg/mL、22.38 pg/mL、89.41 pg/mL，均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；軟骨水解物組、膠原蛋白肽組和硫酸軟骨素組的關(guān)節(jié)炎模型大鼠中TNF-α、IL-1β、PGE-2水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)，均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。說明使用軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素對關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGE-2的水平，減輕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)，從而起到抗炎作用。曹慧[32]等研究發(fā)現(xiàn)使用雞胸軟骨酶解產(chǎn)物能夠降低炎癥因子TNF-α水平，提示其治療作用機(jī)理可能與抑制炎癥因子的分泌有關(guān)。Sun Y[33]等研究發(fā)現(xiàn)使用鱘魚骨硫酸軟骨素能夠抑制碘乙酸鈉所致的大鼠關(guān)節(jié)炎中TNF-α、IL-1β、PGE-2的水平，減輕關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛反應(yīng)。本文還發(fā)現(xiàn)軟骨水解物組大鼠TNF-α、PGE-2水平分別為11.71 pg/mL、54.19 pg/mL，均低于膠原蛋白肽和硫酸軟骨素組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），說明雞胸軟骨水解物中膠原蛋白肽和硫酸軟骨素可能起到協(xié)同抗炎作用。使用軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素對大鼠IL-1β水平影響差異不顯著，考慮可能是由于膠原蛋白肽和硫酸軟骨素的比例問題，具體原因需要進(jìn)一步的探究。

表5 大鼠TNF-α、IL-1β、PGE-2水平的比較Table 5 Comparison of TNF-α, IL-1β and PGE-2 levels in rats of each group (±s)

表5 大鼠TNF-α、IL-1β、PGE-2水平的比較Table 5 Comparison of TNF-α, IL-1β and PGE-2 levels in rats of each group (±s)

組別 只數(shù)(n) TNF-α/(pg/mL) IL-1β/(pg/mL) PG-E2/(pg/mL)正常組 7 9.68±3.62c 11.16±4.42c 40.09±6.11d模型組 7 39.90±9.64a 22.38± 4.12a 89.41±8.86a雞胸軟骨水解物組 7 11.71±2.97c 17.75±2.07b 54.19±9.86c膠原蛋白肽組 7 21.42±4.47b 19.31±2.28ab 73.41±9.88b硫酸軟骨素組 7 19.02±3.04b 16.97±1.51b 67.11±7.37b陽性組 7 10.14±2.44c 16.32±2.98b 48.96±7.15cd

3 結(jié)論

3.1 雞胸軟骨膠原蛋白肽和硫酸軟骨素的得率分別為68.32%（以干重計(jì)）和18.82%（以干重計(jì)）。軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素掃描電鏡結(jié)果顯示三者的微觀結(jié)構(gòu)存在明顯差異。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明，軟骨水解物中特征吸收帶酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶都能被檢測到，硫酸軟骨素樣品中含有軟骨素-4-硫酸鹽和軟骨素-6-硫酸鹽的典型特征，表明硫酸軟骨素樣品主要由硫酸軟骨素A組成。氨基酸分析結(jié)果表明膠原蛋白肽中甘氨酸含量最高，可達(dá)14.05 mg/g，其次為谷氨酸（9.09 mg/g）和脯氨酸（7.44 mg/g）。紫外光譜圖與圓二色性結(jié)果共同驗(yàn)證了所提取的樣品具有膠原蛋白肽的典型特征，通過高效液相色譜測得膠原蛋白肽中肽分子量在1000 u以下的占92.38%，表明膠原蛋白肽樣品中主要為小分子肽。瓊脂糖凝膠電泳、二糖組成分析結(jié)果再次表明硫酸軟骨素樣品主要由硫酸軟骨素A組成。通過 Lowery法計(jì)算得到所提取的硫酸軟骨素樣品相對純度為91.87%。

3.2 雞胸軟骨水解物對大鼠骨關(guān)節(jié)炎具有調(diào)節(jié)作用，迄今還未有文獻(xiàn)報(bào)道其抗炎活性。本研究以碘乙酸鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠為模型，通過斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用雞胸軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素可增加大鼠斜板支撐角度，減輕大鼠的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。膠原蛋白肽和硫酸軟骨素可能起到協(xié)同抗炎效果，且雞胸軟骨水解物中硫酸軟骨素對碘乙酸鈉誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥有較好的緩解作用。通過探討對大鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE-2水平的比較，表明使用軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素對關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后，TNF-α、IL-1β、PGE-2水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)，說明使用軟骨水解物、膠原蛋白肽和硫酸軟骨素能夠下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGE-2的水平，減輕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)，從而起到抗炎作用，為進(jìn)一步探究膠原蛋白肽和硫酸軟骨素的協(xié)同抗炎效果提供理論依據(jù)。