吳 潔，楊 梅

(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

吉林省的玉米秸稈纖維素資源非?？捎^，然而很大一部分的秸稈沒(méi)有得到合理化的利用，反而被大量的棄置、焚燒.進(jìn)而引發(fā)很嚴(yán)重的高消耗、高污染、低產(chǎn)出的狀況.如今，怎樣實(shí)現(xiàn)可再生植物纖維資源的高效利用與轉(zhuǎn)化，對(duì)于我國(guó)的能源、環(huán)境以及循環(huán)經(jīng)濟(jì)的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)重大的機(jī)遇和轉(zhuǎn)折點(diǎn)[1].因此將纖維素水解成葡萄糖等物質(zhì)，繼而應(yīng)用到食品制造、飼料加工、酒精發(fā)酵等眾多領(lǐng)域，使纖維素可以得到重復(fù)利用，對(duì)緩解人類能源緊缺以及環(huán)境污染等問(wèn)題具有重要意義.

秸稈中的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，目前較為常見(jiàn)的纖維素降解方法為物理、化學(xué)、生物降解這3個(gè)方面.微生物降解處理纖維素是一種相對(duì)更為安全、無(wú)公害的方法，也是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[2].利用微生物生產(chǎn)纖維素酶普遍存在活力低、成本高等問(wèn)題，制約著纖維素資源利用的進(jìn)一步發(fā)展.因此，開(kāi)發(fā)纖維素酶高產(chǎn)菌種并加強(qiáng)菌株選育等基礎(chǔ)研究，是纖維素資源高效利用的關(guān)鍵所在.本文從多年種植玉米地土壤中分離出1株高效纖維素降解菌，該菌命名為J-N3,并初步考察其酶學(xué)性質(zhì)以及秸稈的降解效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 樣品來(lái)源

土壤樣品采集：吉林市郊區(qū)多年種植玉米田地，去除表層土5 cm，取距地表5～10 cm的土壤樣品，置于無(wú)菌袋中.將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，后過(guò)40目篩，置于4 ℃冰箱保存.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA液體(固體)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，自來(lái)水1 000 mL，自然pH.

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5.0 g、秸稈粉 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH自然.

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：分別稱取羧甲基纖維素鈉15 g、NaCl 0.5 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、K2HPO41 g、酵母膏0.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0.

赫奇遜(Hutchison)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g·L-1) ：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5、FeCl30.01、CaCl20.01、瓊脂粉18 g，pH 7.2左右.

發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、FeCl30.01 g、CaCl20.1 g、玉米秸稈粉20 g，pH 7.0.

1.1.3 主要儀器

滅菌鍋滅菌鍋(YXQ-LS上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；干燥箱(DHG-9240A上海一恒科技有限公司)；無(wú)菌操作臺(tái)(JHL-1500北京萊博特瑞科技有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV2600貴州賽蘭博科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；恒溫振蕩器(HZQ-X300上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱LRH-70/70F上海一恒科學(xué)儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選

稱取1 g土樣置于含有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中,并放入玻璃珠充分打散混勻,在30 ℃、150 r/min條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，將純化后的菌株，用接種環(huán)挑取單菌落，于羧甲基纖維素(CMC)固體培養(yǎng)基平板上點(diǎn)種3個(gè)點(diǎn)，放入恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃倒置培養(yǎng)3 d[3].等待菌落長(zhǎng)出，此時(shí)用1 mg·mL-1剛果紅染液對(duì)其進(jìn)行染色30 min，之后棄掉所用剛果紅染液，其次吸取1 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行脫色30 min.稍后呈現(xiàn)出明顯的透明圈，測(cè)其透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)大小，選取D/d值較大(D/d值越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng))的進(jìn)行復(fù)篩.

1.2.2 濾紙降解實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)驗(yàn)所得菌株，置于液體培養(yǎng)基中以30 ℃，150 r/min于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)制備菌液[4].在100 mL赫奇遜無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入1 cm×6 cm的濾紙條，接入5 mL菌液之后進(jìn)行恒溫震蕩，為避免震蕩導(dǎo)致濾紙斷裂，同時(shí)滿足該菌株生長(zhǎng)所需的有氧條件，本實(shí)驗(yàn)采用的搖床轉(zhuǎn)速為80 r/min，培養(yǎng)20 d，觀察濾紙條的斷裂情況判斷降解效果[5-6].

1.2.3 纖維素酶活測(cè)定

粗酶液的制備：將初篩得到的單菌株制成菌懸液，以5%的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，35 ℃，150 r/min搖床中培養(yǎng).在8 000 r/min條件下，將培養(yǎng)液離心10 min，取其上清液作為粗酶液.

CMCase活力的測(cè)定[7]：取0.5 mL 稀釋的酶液和1.5 mL的1%CMC-Na溶液，放入50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min,加入3.0 mL的DNS 試劑，沸水浴10 min,冷卻后定容至25.0 mL.在540 nm處測(cè)OD值,并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出酶解所得葡萄糖含量,換算成酶活力值.

濾紙酶活力的測(cè)定[8]：取新華濾紙50 mg放入試管中,加入 0.5 mL粗酶液和1.5 mL檸檬酸緩沖液,在 50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min,加入3.0 mL DNS溶液,沸水浴10 min,冷卻后定容至25.0 mL.在540 nm處測(cè)OD值,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶活力值.

1.2.4 秸稈降解率測(cè)定

接種篩選菌株到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制備菌液，按接種量5%制備好的菌液到含有秸稈的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行恒溫震蕩培養(yǎng)[9].秸稈降解過(guò)程中，于5、10、15、20 d 取各組秸稈并用自來(lái)水清洗干凈后，置于 85 ℃烘箱中烘干至恒重，用減重法測(cè)定秸稈失重率，同時(shí)，每組分別取秸稈粉(將秸稈粉碎后過(guò)40目篩)1 g，按照Van Soest 法[10]測(cè)定秸稈降解過(guò)程中纖維素分解率.

1.2.5 菌株鑒定

觀察菌落及菌體形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]和《中國(guó)真菌志》[12]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.

分子生物學(xué)鑒定提取細(xì)菌基因組總DNA，擴(kuò)增16S rDNA和5.8S rDNA之間的保守序列，PCR引物為27F：(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)，1492R：(TACGGYTACCTTGTTACGACTT).PCR反應(yīng)體系為 25 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；循環(huán)30次；72 ℃ 10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,進(jìn)行比較分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離篩選

將有分解纖維素能力的菌株和篩選到菌株點(diǎn)接于鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)0.1%剛果紅染色和1 mol·L-1NaCl 溶液脫色后，有4個(gè)菌株形成的透明降解圈較大.隨后,對(duì)這4個(gè)菌株進(jìn)行濾紙降解實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表1所示.最后對(duì)其進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)并測(cè)定其發(fā)酵上清液酶活，見(jiàn)表2.其中，菌株J-N3發(fā)酵上清液的羧甲基纖維素酶酶活為64.92±0.11 U·mL-1，F(xiàn)PA為39.75±0.10 U·mL-1，其中第3種酶活力較其他3個(gè)菌株高，故以此菌株為研究對(duì)象開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn).

表1 剛果紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 各菌株發(fā)酵上清液纖維素酶酶活

2.2 菌株的鑒定

菌落較大，顏色呈現(xiàn)灰白且略帶些黃色，其表面粗糙且無(wú)規(guī)則，并伴有隆起、皺褶等，如圖1所示.

圖1 菌株J-N3菌落形態(tài)特征

僅通過(guò)對(duì)菌落的形態(tài)觀察尚不能確定菌株的具體種屬，還需通過(guò)分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步 鑒定.提取菌株J-N3的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)得其ITS序列長(zhǎng)度為531bp，于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，ITS 序列與J-N3相似性最高的菌株屬于芽孢桿菌，如表3所示.

表3 纖維素降解菌株的相似菌種及相似度

2.3 菌株J-N3所產(chǎn)纖維素酶的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

取活化后的菌種，按5%接種量于250 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，35 ℃、150 rmp震蕩培養(yǎng)7 d，每培養(yǎng)24 h取樣1次，連續(xù)測(cè)定纖維素酶活力，如圖2研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株發(fā)酵液酶活力的影響.

t/d圖2 時(shí)間對(duì)酶活的影響

2.3.2 酶的最適反應(yīng)pH

在50 ℃條件下，分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液體系中，測(cè)定該纖維素酶活力.由圖3可知，該纖維素酶的最適反應(yīng)pH為6.0.在pH 4.0～6.0之間，纖維素酶活力逐漸升高；在pH 6.0～8.0之間，纖維素酶活力有小幅降低.

pH圖3 pH對(duì)酶活的影響

2.3.3 酶的最適反應(yīng)溫度

在pH 6.0體系中，分別在30、40、50、60、70、80 ℃下，測(cè)定該纖維素酶活力.由圖4可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃；其對(duì)溫度的適應(yīng)性較強(qiáng)，在 30～50 ℃之間，酶活力都維持在較高增長(zhǎng)水平；當(dāng)溫度高于 50 ℃ 時(shí)，纖維素酶活力迅速下降.

T/℃圖4 溫度對(duì)酶活的影響

2.4 菌株J-N3對(duì)玉米秸稈的降解效果

對(duì)同一取樣時(shí)間段的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，20 d 時(shí)，菌株J-N3處理組秸稈失重率為26.22%，每組取秸稈粉1 g，用于測(cè)定秸稈中的纖維素含量，并計(jì)算纖維素分解率，此時(shí)菌株處理組纖維素分解率達(dá)到31.01%.綜合玉米秸稈失重率和纖維素分解率的測(cè)定結(jié)果，表明菌株對(duì)玉米秸稈具有良好的降解功能.

3 結(jié) 論

近年來(lái)對(duì)纖維素降解菌的研究越來(lái)越關(guān)注，農(nóng)作物秸稈是自然界中最豐富的可再生資源，如何有效利用秸稈纖維素是普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn).本研究篩選獲得 1 株高產(chǎn)纖維素酶的菌株J-N3.結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果可知，菌株 J-N3為芽孢桿菌屬.并對(duì)其所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，該酶在發(fā)酵第3 d時(shí)CMC酶活最高，最適反應(yīng)pH為 6.0，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，并且菌株對(duì)玉米秸稈具有良好的降解功能.玉米秸稈經(jīng)菌株 J-N3處理20d 時(shí)，秸稈失重率及纖維素分解率分別達(dá)到26.22%和31.01%.