張 浩，趙 影，婁大偉

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

基因檢測對遺傳疾病診斷、癌癥治療和傳染病控制意義非凡[1].2002年爆發(fā)的非典與2019年的新冠肺炎這兩種重大傳染病都與病毒有關(guān),在這兩件實例中基因檢測是有效的篩查手段.除傳染病外,細菌對抗生素治療的耐藥性也是我們面對的難題,2015年研究者發(fā)現(xiàn)了一種抗生素耐藥性基因相關(guān)的耐藥機制[2].這些事例表明,展開對基因檢測方法的研究是非常有必要的.目前基因檢測的方法有毛細管電泳法[3]、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[4]、電化學(xué)發(fā)光法[5]等,而這些方法不可避免的要經(jīng)歷耗時繁瑣的步驟和高昂的成本,建立一種成本低廉、方便快速的基因檢測方法成為近年來的研究熱點.

DNA是生物學(xué)中遺傳信息的主要分子載體[6],它的構(gòu)象非常靈活,隨著人工合成DNA技術(shù)的發(fā)展,DNA被越來越多的人用作納米顆粒模板[7].銀納米簇(AgNCs)由幾個至幾百個銀原子組成[8],由于其在納米尺度上的光學(xué)性能優(yōu)于其他過渡金屬而被廣泛關(guān)注[9],使用DNA為模板合成的銀納米簇(DNA-AgNCs)具有生物相容性好、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點[10],基于發(fā)卡狀銀納米簇?zé)晒馓结槥榛驒z測提供了一種降低成本、簡化操作過程的新思路.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀(AgNO3)和硼氫化鈉(NaBH4)購買自國家醫(yī)藥集團化學(xué)試劑有限公司.實驗中涉及的試劑均為分析純且無進一步純化.實驗中使用的超純水均取自Mill-Q試劑水系統(tǒng).熒光發(fā)射光譜測試結(jié)果記錄于F97XP(上海棱光技術(shù)有限公司)熒光分光光度計,激發(fā)波長為466 nm,激發(fā)帶寬與發(fā)射帶寬分別為10 nm.熒光銀納米簇在SHA-C 恒溫往復(fù)水浴鍋中合成.緩沖溶液pH值通過Sartorius PB-10 pH計(中國北京標(biāo)準(zhǔn)儀器有限公司)校準(zhǔn).本文涉及的DNA樣品購買于上海Sangon 生物科技有限公司,其序列如表1所示.

表1 DNA序列

1.2 實驗過程

銀納米簇的制備:在小管中依次滴入10 μL 30 μM發(fā)卡狀探針probe,50 μL 100 μM pH=7.4的Tris-HNO3緩沖溶液，40 μL水,室溫震蕩2 h,隨后加入100 μL Tris-HNO3和60 μL水10 μL 180 μM AgNO3溶液,震蕩5 min后加入10 μL 180 μM NaBH4溶液繼續(xù)震蕩5 min隨后25 ℃水浴6 h.

可行性試驗:分別制備空白樣與試驗樣,空白樣A中僅含有發(fā)卡狀探針probe,試驗樣B中同時含有發(fā)卡狀探針probe與乙肝病毒合成序列HBV[11],在熒光分光光度計上分別檢測二者熒光強度并記錄.

制備條件的探究:為了優(yōu)化實驗條件,對制備過程中的合成時間,反應(yīng)溫度以及探針與硝酸銀的摩爾比進行了探究.

HBV序列的檢測:使用探針probe對人工合成序列HBV的一系列濃度進行了熒光強度的檢測.

選擇性試驗:選擇3種與HBV相似但不同的DNA序列作為類似物對探針的選擇性進行了探究.

2 結(jié)果與討論

2.1 機理及可行性分析

當(dāng)待測液中不含HBV時,探針probe自發(fā)組裝為發(fā)卡狀,此時向溶液中加入硼氫化鈉來還原硝酸銀得到的銀納米簇呈現(xiàn)較弱熒光.向探針probe中加入HBV后,HBV的序列與環(huán)狀識別區(qū)結(jié)合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu),將發(fā)卡狀探針probe打開,此時在溶液中再加入硼氫化鈉與硝酸銀時整個體系的熒光強度顯著增加.這個現(xiàn)象是因為選用了一個能生成銀納米簇的DNA模板序列C3AC3AC3TC3A[12].在發(fā)卡打開時,此模板形成i-motif結(jié)構(gòu),可作為模板誘導(dǎo)合成有熒光的銀納米簇.發(fā)卡沒打開的時候,部分形成的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)會阻礙i-motif結(jié)構(gòu)的形成,從而導(dǎo)致熒光強度下降.熒光強度的變化與HBV的濃度正相關(guān),據(jù)此實現(xiàn)對HBV的基因檢測.

對提出的檢測方法進行可行性分析.如圖1(a)所示,使用466 nm為激發(fā)波長時在540 nm處得到明顯的吸收峰,這表明合成了發(fā)射藍綠光的熒光銀納米簇.分別測試了當(dāng)待測液中僅含有探針probe和探針probe與HBV共存時的熒光發(fā)射光譜,結(jié)果如圖1(b)所示,向探針probe中加入HBV后體系熒光明顯增強,我們可以依據(jù)熒光變化程度對HBV濃度進行檢測.

(a)探針DNA1檢測HBV的機理圖

Wavelength/nm(b)探針DNA1的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

Wavelength/nm(c)空白樣品與試驗樣品的熒光發(fā)射光譜圖1 可行性分析

2.2 實驗條件的優(yōu)化

在銀簇合成過程中,時間與溫度等實驗條件對銀簇有較大影響,因此對合成時間、反應(yīng)溫度以及探針probe與硝酸銀的摩爾比進行了研究.實驗結(jié)果如圖2所示,如圖2(a)所示,隨著反應(yīng)時間的增長,熒光的變化程度在逐漸增大,6 h以后熒光強度的變化程度趨于平緩,這說明銀納米簇在6 h就可完全形成,因此合成時間選擇6 h.在合成銀簇的實驗中,4 ℃與25 ℃是兩個常用溫度,所以我們對其進行了探索,結(jié)果如圖2(b)所示,在同樣反應(yīng)了6 h后,反應(yīng)溫度為25 ℃時熒光強度的變化更為明顯,所以選擇25 ℃作為反應(yīng)溫度.此外,分別探究探針probe與硝酸銀摩爾比為1：3、1：6、1：9、1：12、1：15時的熒光變化程度,圖2(c)表明n(DNA1)：n(AgNO3)為1：6時實驗效果最好,此實驗結(jié)果也符合銀納米簇模板序列i-motif結(jié)構(gòu)的化學(xué)計量學(xué)比例.所以我們在25 ℃,n(DNA1)：n(AgNO3)為1：6,反應(yīng)6 h的條件下來制備熒光銀納米簇.

t/h(a)時間與熒光變化程度的關(guān)系

T/℃(b)溫度與熒光變化程度的關(guān)系

(c)DNA和硝酸銀之間的摩爾比與熒光變化程度的關(guān)系圖2 實驗條件的優(yōu)化

2.3 基因序列的檢測

用設(shè)計好的探針probe對一系列不同濃度的HBV進行檢測,具體濃度分別為0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μM.檢測結(jié)果如圖3所示,圖3(a)表明隨著HBV在待測液中濃度的升高,發(fā)生了輕微藍移,熒光強度也隨之加強,且在0.05～1 μM間有良好的線性關(guān)系,線性方程為F=545.92+1266.85C(HBV),檢出限為0.016 μM.

Wavclength/nm(a)含有一系列不同濃度HBV待測液的熒光發(fā)射光譜

Concentration/μm(b)HBV濃度與熒光強度的關(guān)系圖3 HBV的檢測

2.4 選擇性

為了探究探針probe對HBV的選擇性,選擇了3種與HBV相似但不同的人工合成序列作為類似物,并對其進行分析.結(jié)果如圖4所示.

圖4 探針DNA1對HBV的選擇性

探針對HBV的響應(yīng)最高,其他類似物的序列無法打開發(fā)卡狀結(jié)構(gòu),說明所設(shè)計的探針選擇性良好.

3 結(jié) 論

基于人工合成DNA設(shè)計了一種探針來檢測HBV,當(dāng)HBV存在時會引起DNA結(jié)構(gòu)變化來誘導(dǎo)合成熒光銀納米簇,并對反應(yīng)時間、合成溫度、摩爾比等對體系熒光有影響的因素進行了探究,在最優(yōu)實驗條件下該探針選擇性良好,在0.05～1 μM間有良好的線性關(guān)系,檢出限低,整個檢測方法耗時短且成本低.