周武林，高惠芳，吳玉玲，張顯，徐美娟，楊套偉，邵明龍，饒志明

（江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122）

引 言

近年來，甾體藥物因具備良好的抗炎、抗過敏和避孕等作用而備受生物醫(yī)藥行業(yè)的高度重視[1]。菜油甾醇是甾體藥物（孕酮、雄烯二酮、氫化可的松等）的一種重要合成前體，也是植物來源的主要甾醇之一[1-2]。其與動物來源的主要甾醇（膽固醇）的結(jié)構(gòu)僅在C24位多出一個甲基，與微生物來源的主要甾醇（麥角甾醇）的區(qū)別在于C7～8和C22～23位是飽和單鍵。因此，這為微生物法生產(chǎn)菜油甾醇提供了可行性的理論基礎(chǔ)[3]。

目前，甾體類藥物主要通過化學合成和生物催化兩種主要方式進行生產(chǎn)[4-7]。由于化學合成法會造成嚴重的環(huán)境污染且中間步驟復雜，因此，生物催化因其綠色環(huán)保且反應(yīng)過程簡易而受到了極大的關(guān)注[8]。然而，由于甾體類藥物及其中間體水溶性較差，難以進出細胞被利用，造成了生物催化生產(chǎn)甾體類藥物的較低生物轉(zhuǎn)化率。雖然有添加助溶劑以及將底物溶解于有機溶劑中進行添加等方法來提高微生物對底物的利用率，但轉(zhuǎn)化率仍然不是很高[9-11]。已知酵母細胞體內(nèi)存在著一條天然的甾醇合成途徑（圖1），因此可作為合成甾體藥物的優(yōu)良底盤細胞，以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甾體藥物。其中釀酒酵母作為公認的模式安全（GRAS）生物，對低pH和發(fā)酵抑制劑有很高的耐受性，因此釀酒酵母被認為是生產(chǎn)生化試劑的首選底盤細胞[12]。除此之外，釀酒酵母作為容易操作的真核細胞生物之一，對其生理和代謝擁有豐富的知識以及現(xiàn)有的各種可實用的基因組遺傳操作系統(tǒng)（如:目前最高效的CRISPR-CAS系統(tǒng)），為釀酒酵母的工程化改造提供了堅實的基礎(chǔ)[13-15]。研究表明，菜油甾醇可以取代麥角甾醇成為酵母中的主要甾醇，其生物膜活性不受影響[16]。目前，已有文獻報道在釀酒酵母體內(nèi)成功構(gòu)建了氫化可的松，皮質(zhì)酮以及孕酮等多種甾體物質(zhì)的從頭合成[2]。此外，有文獻報道在解脂耶氏酵母體內(nèi)通過導入外源的7-脫氫膽固醇還原酶DHCR7（7-dehydrocholesterol reductase DHCR7）和敲除C-22甾醇去飽和酶Erg5（C-22 sterol desaturase Erg5），來使麥角固醇的C7～8位以及C22～23位的雙鍵飽和，構(gòu)建了一條菜油甾醇生物合成途徑（圖1）[17-18]。但是，目前酵母體內(nèi)生物合成甾體藥物仍然處于一個低水平狀態(tài)。

圖1 釀酒酵母體內(nèi)菜油甾醇生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathway of campesterol in Saccharomycescerevisiae

本研究中，首先采取了多樣性酶來源的篩選策略，通過同源性分析和序列比對，得到了75種不同來源的DHCR7，再從中隨機挑選了10種來源的DHCR7采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將ERG5基因替換成DHCR7基因來構(gòu)建菜油甾醇合成途徑的同時解除麥角固醇競爭途徑，進而構(gòu)建一條高效的菜油甾醇合成途徑。然后，結(jié)合啟動子優(yōu)化以及增加DHCR7表達盒在基因組中的拷貝數(shù)的方式，提高DHCR7在酵母體內(nèi)的表達水平以構(gòu)建一株高產(chǎn)菜油甾醇的酵母細胞。最終采用補料分批發(fā)酵策略，菜油甾醇產(chǎn)量達到了916.88 mg/L。本實驗結(jié)果，為后續(xù)的甾體類藥物的生物合成提供了一個很好的平臺，也為其他化學藥物的生物合成提供了科學理論參考。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及培養(yǎng)基 本研究使用的所有菌株和質(zhì)粒均列在表1中，大腸桿菌所用的培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。酵母細胞的生長培養(yǎng)基為YPD：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖。誘導培養(yǎng)基為YPG：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、20 g/L半乳糖。營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基為SC-URA。配制固體培養(yǎng)基時加入2%的瓊脂粉。5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/L酵母膏、20 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖。補料培養(yǎng)基：5 g/L酵母膏、10 g/L蛋白胨、400 g/L葡萄糖。

表1 本研究所有菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

續(xù)表1Table 1 continued

1.1.2 基因和引物 本實驗中所使用的DHCR7基因分別來源于Carassius auratus(XP_026124274.1)，Pangasianodonhypophthalmus(XP_026786162.2)，Triplophysa tibetana(KAA0723749.1)，Labeo rohita(RXN17635.1)，Danio rerio(NP_958487.2)，Cyprinus carpio(XP_018972396.1)，Colossomamacropomum(XP_036442229.1)，Astyanaxmexicanus (XP_007254692.2)，Cottoperca gobio(XP_029284590.1)和Xiphophorus maculates(XP_005812111.1)，分別經(jīng)釀酒酵母密碼子優(yōu)化后，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并連接到pET-28a質(zhì)粒中，本實驗中的擴增基因整合片段時所使用的引物序列均由網(wǎng)站軟件工具CASDesigner(http://casdesigner.jbei.org)在線生成。所使用的引物如表2所示。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶購于大連寶生物生物工程有限公司；用于DNA片段純化和質(zhì)粒提取的mini DNA快速純化試劑盒和質(zhì)粒miniprep試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司，Ultrapure RNA Kit超純RNA提取試劑盒購自康為世紀。菜油甾醇、膽固醇、麥角固醇以及正己烷均為色譜純購于Sigma公司；其他試劑購自于國藥集團。

1.1.4 主要儀器 PCR儀，德國Eppendorf公司；UVP凝膠成像儀，上海天能；核酸電泳系統(tǒng)，北京市六一儀器廠；蛋白電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；賽默飛U3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；恒溫振蕩金屬浴，上海一恒科技有限公司；氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 遺傳操作方法 根據(jù)先前報道的酵母基因編輯方法，在Cas9蛋白輔助作用下同源重組整合或者敲除指定基因[20]。通過使用CASdesigner生成的引物來PCR擴增供體DNA片段，以構(gòu)建一個整合的表達盒（通常包含兩個1 kb側(cè)翼同源區(qū)，啟動子，基因序列和終止子），該盒包含靶向所選基因組位點的1 kb側(cè)翼同源區(qū)域，然后與靶向該基因的Cas9-gRNA質(zhì)粒（pCut）共轉(zhuǎn)化進入酵母細胞。此外，CASdesigner所設(shè)計的引物在片段之間會提供30～60 bp的同源臂，因此，在酵母體1～5個單獨的片段可以進行同源重組自組裝。靶向基因組基因座的pCut質(zhì)粒是從線性骨架和包含新gRNA序列的線性PCR片段體內(nèi)組裝而成的。新的sgRNA由在線sgRNA設(shè)計工具（http://yeastriction.tnw.tudelft.nl/#!/）所產(chǎn)生。

1.2.2 釀酒酵母細胞感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化 釀酒酵母轉(zhuǎn)化根據(jù)先前報道描述的方法進行[20]。將新鮮過夜培養(yǎng)的酵母細胞接種到2×YPD培養(yǎng)基至OD600為0.2，在30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600為1.0。然后，收集5 ml培養(yǎng)液于8000 r/min離心5 min，加入2.5 ml的H2O洗滌兩次。使用含有供體DNA片段（2μg）和pCUT質(zhì)粒（0.25 ng）的50μl水溶液對細胞沉淀進行重懸，加入至轉(zhuǎn)化反應(yīng)液（260μl 50%PEG3350、36μl 1 mol/L LiOAc，10μl ssDNA，4μl H2O）中混合。將混合液在42℃溫育40 min，并通過以6000 r/min離心1 min收集沉淀。細胞沉淀重懸于500μl H2O中，然后取100μl H2O在選擇性瓊脂平板（SC-U）上涂布均勻。通過測序驗證整合的結(jié)果，挑取正確的菌落在消除質(zhì)粒后用于下游實驗操作。

1.2.3 產(chǎn)菜油甾醇重組酵母菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 將甘油管中的重組酵母菌在YPD固體平板上劃線活化，生長48 h后。挑取單菌落接入10 ml/50 ml的小瓶液體YPD種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。然后，以2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 ml/250 ml的液體YPD培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min條件下發(fā)酵48 h，接著收集細胞轉(zhuǎn)移至50 ml/250 ml的液體YPG培養(yǎng)基中進一步發(fā)酵96 h。收集細胞，進行菜油甾醇的提取與檢測。

將單菌落接種于10 ml一級種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，再以5%的接種量接入至100 ml二級種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，10%的接種量接種于2 L發(fā)酵培養(yǎng)基中?？刂? L發(fā)酵罐中發(fā)酵參數(shù)，溫度、pH、通氣量及攪拌速率分別控制在30℃、5.5、2 m3/(m3·min)和500 r/min。監(jiān)測發(fā)酵液中殘?zhí)橇?，待培養(yǎng)基中葡萄糖消耗完畢，開始補加半乳糖，待半乳糖快消耗完時立即補加至40 g/L，直至發(fā)酵結(jié)束。葡萄糖含量用生物傳感分析儀SBA-40E進行測定，半乳糖含量用HPLC法進行檢測：視差檢測器RID，色譜柱為氰柱，柱溫80℃，流動相為超純水，流速0.6 ml/min，檢測溫度55℃。

1.2.4 菜油甾醇的提取與檢測 取1 ml菌液離心收集細胞，加入2 ml皂化反應(yīng)液（20%KOH-50%C2H5OH）且加入100μl 1 g/L膽固醇作為內(nèi)標，置于85℃溫浴2 h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入6 ml正己烷充分振蕩萃取，取上層萃取液于氮吹儀中用氮氣吹干，加入1 ml色譜級甲醇復溶。經(jīng)0.22μm膜過濾后，通過ThermoFisher HPLC分析，色譜柱為Diamonsil C18，5μm，250 mm×4.6 mm，檢測器為紫外檢測器。在205 nm處檢測到菜油甾醇和膽固醇，流動相純甲醇組成；流速為1 ml/min，柱溫為30℃。

1.2.5 RNA提取和實時熒光定量PCR分析 取1 ml菌液離心收集細胞，加入600μl山梨醇緩沖液（以0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液配制1.2 mol/L山梨醇溶液）并加入10μl蝸牛酶，進行30℃破壁處理30 min。然后再根據(jù)相應(yīng)的RNA提取試劑盒（CW2581s）提取酵母RNA。將已提取好的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將cDNA的濃度稀釋至20 ng/μl作為模板，利用SYBR?Green I試劑進行Real Time PCR，內(nèi)參基因選擇ACT1。RT-qPCR所用引物如表2所示。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 菜油甾醇生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

2.1.1 脫氫膽固醇還原酶DHCR7生物多樣性分析DHCR7作為菜油甾醇合成途徑的關(guān)鍵酶，可還原于麥角甾-5,7-二烯醇的C7～8位的雙鍵生成菜油甾醇。目前已有文獻報道，根據(jù)來自Methylomicrobium alcaliphilum20Z的同源蛋白Δ14-甾醇還原酶（MaSR1，PDB登錄號4quv）的晶體結(jié)構(gòu)，建立了Human，Rallus norvegicus和Oryza saliva等多種來源的DHCR7的結(jié)構(gòu)模型[17,21]。DHCR7包含十個螺旋，其中九個（1～9螺旋）據(jù)報道是跨膜片段[22],在MaSR1和DHCR7兩種蛋白與NADPH結(jié)合的殘基是完全保守，基于該模型可知，DHCR7的第6～10個螺旋分別包裹了兩個相互連接的口袋，被認為是用于NADPH和疏水性甾醇底物的結(jié)合[17,23]。

酵母細胞體內(nèi)構(gòu)建異源途徑時，從多樣性來源篩選高效酶是提高異源途徑生產(chǎn)力的有效策略。據(jù)目前文獻報道，來自D.rerio的DHCR7已被證明是目前最高效的菜油甾醇作用酶[18]。在本研究中，為了能夠進一步篩選出更加高效的作用酶，以DrDHCR7為基礎(chǔ)進行了生物信息學分析以及同源性比對（圖2）[24]。發(fā)現(xiàn)DrDHCR7與來源于C.auratus等75種物種中的DHCR7高度同源，同源性高達78.83%～93.10%。因此，本研究從中選擇了C.auratus（同源性92.68%），C.carpio（同源性93.10%），T.tibetana（同源性91.37%），L.rohita（同源性92.26%），P.hypophthalmus（同源性82.64%），C.macropomum（同源性86.40%），A.mexicanus（同源性85.77%），C.gobio（同源性80.71%），X.maculatus（同源性79.87%）9種不同物種來源的DHCR7進行本研究的后續(xù)實驗，以期篩選出最佳的DHCR7用以構(gòu)建高效菜油甾醇生產(chǎn)菌株。

圖2 多樣性來源的DHCR7進化樹Fig.2 DHCR7 evolutionary tree fromdiverse sources

2.1.2 菜油甾醇合成途徑的構(gòu)建 在酵母細胞整個甾醇的合成途徑中，角鯊烯是極為重要的前體物質(zhì)（圖1），對后續(xù)甾醇物質(zhì)的合成起著至關(guān)重要的作用[25-26]。因此，在本研究中，選擇了角鯊烯高產(chǎn)菌株GTy23作為本實驗出發(fā)菌株，由先前文獻所報道該菌株是S.cerevisiaeBY4742經(jīng)基因改造所獲得的，該菌株提供了豐富的角鯊烯前體，這也為菜油甾醇的高水平合成提供了良好的前提條件[19]。在酵母體內(nèi)，內(nèi)源麥角固醇合成途徑是外源菜油甾醇合成途徑的競爭分支途徑（圖1），為了減少分支途徑的競爭，本研究采用了CRISPR/Cas9技術(shù)，將S.cerevisiae內(nèi)源ERG5基因替換成不同來源的DHCR7基因[圖3(a)]，最終構(gòu)建得到整合有不同來源DHCR7的菜油甾醇生產(chǎn)菌株。經(jīng)YPD搖瓶發(fā)酵驗證，結(jié)果如圖3(b)所示，含有PhDHCR7的菌株Zw507表現(xiàn)出了最高的菜油甾醇的產(chǎn)量216.93 mg/L，比菌株Zw503（整合了DrDHCR7）的產(chǎn)量167.91 mg/L提高了29.2%（**p≤0.01）。另外，菌株Zw506（整合了CmDHCR7）和Zw509（整合了LrDHCR7）也表現(xiàn)出了較高的菜油甾醇產(chǎn)量，但相比于菌株Zw507仍然存在很大的差距，因此，菌株Zw507被選擇作為后續(xù)實驗操作的起始菌株。

圖3 重組菌株的構(gòu)建（a）以及不同物種來源的DHCR7菜油甾醇產(chǎn)量（b）(**與對照菌株比較p≤0.01；由t檢驗確定，下同)Fig.3 The construction of recombinant strains(a)and the production of DHCR7 campesterol from different species(b)(**p≤0.01 compared with the control strain;as determined by t test.The same below)

2.2 酵母細胞體內(nèi)DHCR7表達水平的優(yōu)化

2.2.1 通過篩選不同啟動子來增加菜油甾醇的產(chǎn)量 在異源基因表達過程中，啟動子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要組成部分，其活性會顯著影響異源基因轉(zhuǎn)錄的起始、持續(xù)時間和表達程度，從而影響外源基因在宿主中的轉(zhuǎn)錄效率，同時對細胞中mRNA的總體豐度和蛋白質(zhì)含量起著決定性作用，最終影響目標產(chǎn)物的合成[27]。為了能夠精準調(diào)控DHCR7的相對表達水平以進一步提高菜油甾醇的合成水平，本研究篩選了10種啟動強度較強的酵母內(nèi)源性啟動子（PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p）與DHCR7基因進行組合[圖4(a)][28-30]。通過熒光定量PCR技術(shù)對其進行轉(zhuǎn)錄水平監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)原始啟動子GAL1p控制下的DHCR7表現(xiàn)出相對較高的轉(zhuǎn)錄水平，但在TEF1p啟動子控制下表現(xiàn)出了最高的轉(zhuǎn)錄水平，比GAL1p啟動子控制下的轉(zhuǎn)錄水平提高了1.21倍（**p<0.01），是TDH2p啟動子和GPD1p啟動子控制下表達水平的14.7倍和6.42倍[圖4(b)]。搖瓶發(fā)酵檢測，DHCR7的轉(zhuǎn)錄水平與菜油甾醇的產(chǎn)量大體趨勢一致，菌株Zw514（TEF1p啟動子控制的PhDHCR7基因）的菜油甾醇產(chǎn)量能夠達到253.35 mg/L，比對照菌株Zw507（GAL1p啟動子控制的PhDHCR7基因）的產(chǎn)量高出了16.8%（**p<0.01）[圖4(c)]。此外，比菌株Zw520（TDH2p啟動子控制的PhDHCR7基因）和菌株Zw519（GPD1p啟動子控制的PhDHCR7基因）的菜油甾醇產(chǎn)量分別高出了400.13%和322.2%。因此，菌株Zw514被選擇來進行后續(xù)的實驗操作。

圖4 不同啟動子與PhDHCR7基因組合的示意圖（a）、PhDHCR7表達量（b）以及菜油甾醇產(chǎn)量(c)Fig.4 Schematic diagram(a),PhDHCR7 expression(b)and campesterol production(c)of combinations of different promoters and DHCR7 genes(**p<0.01)

2.2.2 增加DHCR7在酵母基因組上的拷貝數(shù)來提高菜油甾醇的產(chǎn)量 據(jù)上述結(jié)果分析，菜油甾醇的產(chǎn)量與PhDHCR7表達量大致呈正比，因此，猜想PhDHCR7的表達量可能是菜油甾醇高產(chǎn)的一個限制性因素。為了進一步提高其表達量，本研究通過圖5（a）所示的方法來增加PhDHCR7表達盒在酵母基因組中的拷貝數(shù)，進而提高菜油甾醇的產(chǎn)量。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示[圖5(b)]，隨著PhDHCR7表達盒的拷貝數(shù)增加，菜油甾醇的產(chǎn)量也在逐漸提高，但當拷貝數(shù)增加至3個拷貝時，菌株Zw523達到了最高的菜油甾醇產(chǎn)量302.27 mg/L，比菌株Zw514的產(chǎn)量提高了19.31%（**p<0.01），且再增加其拷貝數(shù)也對菜油甾醇的產(chǎn)量并無影響。同時，雖然PhDHCR7表達盒拷貝數(shù)不斷地增加，但這并沒有對細胞造成顯著傷害。因此，PhDHCR7的過表達并未對酵母細胞造成過重的負擔，限制菜油甾醇產(chǎn)生的很大可能因素是中間前體供應(yīng)不足。雖然所選的出發(fā)菌株能夠高產(chǎn)角鯊烯，但是甾醇后期合成途徑中反應(yīng)酶共計13個[31-32]，一方面由于中間部分酶屬于限速酶（如ERG1、ERG6和ERG11等）導致部分甾醇中間體積累不足[33-35]；另一方面，釀酒酵母體內(nèi)甾醇后期合成途徑中存在其他的競爭分支途徑也會消耗部分中間體[31]。因此，選擇了菌株Zw523進行后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化。

圖5 PhDHCR7表達盒的多重拷貝數(shù)菌株的示意圖（a）以及菜油甾醇產(chǎn)量（b）Fig.5 Schematic diagram(a)and campesterol production(b)of the multiple copy number strain of PhDHCR7 expression cassette(**p<0.01,*p<0.05)

2.3 重組釀酒酵母菌株的高密度發(fā)酵

本研究中，通過代謝工程手段構(gòu)建了高產(chǎn)菜油甾醇的重組菌株Zw523，該菌株比原始生產(chǎn)菌株Zw503的菜油甾醇產(chǎn)量提高了80.02%。為了進一步提高菜油甾醇的產(chǎn)量，本研究在5 L生物反應(yīng)器中，根據(jù)補料分批發(fā)酵的策略對菌株Zw523進行高細胞密度發(fā)酵。Zw523菌株的發(fā)酵分為兩個階段，在第一階段以葡萄糖作為生長碳源。初始的葡萄糖濃度為50 g/L，在發(fā)酵30 h后，葡萄糖幾乎被消耗完全。此時，開始進入第二階段，由于葡萄糖可以抑制半乳糖的誘導，因此在葡萄糖耗盡后添加半乳糖以誘導Zw523菌株中MVA途徑中內(nèi)源酶的高表達進而促進菜油甾醇高效合成。在30 h后，開始往發(fā)酵罐中投加半乳糖補料培養(yǎng)基，并當半乳糖快消耗完時不斷補加半乳糖，持續(xù)發(fā)酵144 h，最終菜油甾醇的產(chǎn)量達到了916.88 mg/L（圖6），其生產(chǎn)強度為6.37 mg/(L·h)。

圖6 重組釀酒酵母Zw523的補料分批發(fā)酵Fig.6 Fed-batch fermentation of recombinant Saccharomyces cerevisiae Zw523

3 結(jié) 論

本研究中，通過生物信息學分析及同源性比對，獲得了75種不同來源的DHCR7，并從中隨機篩選了10種不同物種來源的DHCR7。利用CRISPR/Cas9技術(shù)將內(nèi)源ERG5基因替換成多種來源的DHCR7基因，敲除內(nèi)源麥角固醇分支合成途徑，成功構(gòu)建了高效的菜油甾醇合成途徑。通過搖瓶發(fā)酵，篩選出了最佳物種來源P.hypophthalmus的DHCR7。菌株Zw507達到了216.93 mg/L的菜油甾醇產(chǎn)量，比目前文獻中所報道的攜帶Danio reriol來源DHCR7的菜油甾醇生產(chǎn)菌株Zw503的產(chǎn)量提高了29.2%。ⅩⅢ

然后，為了提高DHCR7在酵母細胞中的表達水平，選擇了10種酵母內(nèi)源性啟動強度較強的啟動子來組合PhDHCR7。通過搖瓶發(fā)酵以及熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)啟動子TEF1p表現(xiàn)出最強的啟動能力，菌株Zw514能夠達到最高的菜油甾醇產(chǎn)量253.35 mg/L。為了進一步提高DHCR7在酵母體內(nèi)的表達水平以提高菜油甾醇的產(chǎn)量，本研究增加了DHCR7基因表達盒的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，當拷貝數(shù)增加至3時，菌株Zw523達到最高的菜油甾醇產(chǎn)量302.27 mg/L。最終，通過5L發(fā)酵罐對重組菌株Zw523進行補料分批發(fā)酵，菜油甾醇的產(chǎn)量達到了916.88 mg/L，其生產(chǎn)強度為6.37 mg/(L·h)。

本研究成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)菜油甾醇的釀酒酵母重組菌株，該菌株可作為后續(xù)的其他甾體藥物（孕烯醇酮、孕酮、氫化可的松）生物合成的底盤細胞。同時，本研究也為其他化學藥物的生物合成提供了理論指導。