羅忠國 李冬梅 張歡 曹玉清 汪航 徐雄

現(xiàn)如今，天然色素絕大部分都是從植物中所提取的，但由于受到提取工藝復(fù)雜等相關(guān)因素的制約，導(dǎo)致提取數(shù)量較少。通過微生物資源生產(chǎn)天然色素，能夠有效克服上述不足之處，同時(shí)也易于工業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)通過對92個(gè)黑木耳菌株進(jìn)行培養(yǎng)，成功獲得1株菌株（紅褐色），將其中的色素進(jìn)行提取，并通過一系列的實(shí)驗(yàn)來研究對色素穩(wěn)定性造成的影響。結(jié)果顯示，這一色素的最大吸收峰為304nm，且不溶于乙醚；光對色素穩(wěn)定性也沒有造成較大影響，具有相對較高的耐高溫性能，抗氧化還原性相對較強(qiáng)。

一、材料與方法

1.供試菌株。選取不同地區(qū)的92個(gè)黑木耳菌株。

2.培養(yǎng)基。（1）PDA固體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。（2）PDA液體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，pH自然。

3.產(chǎn)天然色素黑木耳菌株的篩選。將100mL的PDA液體培養(yǎng)基置于容量為250mL的三角瓶當(dāng)中，再將所有菌株分批接種到三角瓶中，在30℃、200r/min的條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵液當(dāng)中的顏色變化進(jìn)行記錄與觀察，篩選出能夠產(chǎn)生天然色素的菌株。

4.提取與純化。（1）提取。將100mL的PDA培養(yǎng)基加入容量為250mL的三角瓶中，再在三角瓶中接入四個(gè)單位菌塊，然后在30℃、200r/min的條件下?lián)u晃培養(yǎng)8日。發(fā)酵液以10000r/min離心15分鐘，將菌體完全去除，取上清液，采用7mol/L的HCL將pH調(diào)整到2.0，搖晃均勻，靜置2小時(shí)。將上述液體以10000r/min離心15分鐘，棄上清液進(jìn)行烘干，所得到的即為色素粗提物。（2）純化。在色素粗提物中加入5mL濃度為7mol/L的HCL，充分搖晃均勻，沸水浴2小時(shí)，沉淀采用1mol/L的KOH進(jìn)行溶解，之后采用7mol/L的HCL將pH值調(diào)整到2.0。將上述液體以10000r/min離心15分鐘，沉淀采用0.01mol/L的HCL和蒸餾水依次進(jìn)行洗滌，再以10000r/min離心20分鐘，在冷凍干燥機(jī)中干燥24小時(shí)以后，置于-20℃的條件下進(jìn)行保存。

5.色素的溶解性。（1）有機(jī)溶劑的溶解性。稱取4份色素提取物樣品，每份5mg，分別加入裝有丙酮、乙醇、乙醚、甲醇的試管中，輕輕搖晃，30分鐘以后對溶解情況進(jìn)行觀察。（2）水溶液的溶解性。稱取3份色素提取物樣品，每份5mg，分別加入裝有蒸餾水、0.1mol/L的HCL、0.1mol/L的KOH溶液的試管當(dāng)中，充分搖晃均勻，30分鐘以后對溶解情況進(jìn)行觀察；然后將試管放置在80℃當(dāng)中水浴20分鐘，對溶解情況進(jìn)行密切觀察。

二、結(jié)果與分析

1.產(chǎn)天然色素黑木耳菌株的篩選結(jié)果。在92株黑木耳中，一共篩選出2株可以產(chǎn)生色素的菌株，其發(fā)酵液當(dāng)中的顏色發(fā)生一系列變化。其中2株所形成的色素會讓發(fā)酵液呈現(xiàn)為紅褐色，分別為Aua7以及Aua09；其余菌株的發(fā)酵液隨著營養(yǎng)物質(zhì)被充分吸收與利用，其色澤逐漸變得清透，但顏色沒有任何明顯變化。對比篩選出的2株黑木耳，Aua09所出現(xiàn)的顏色相對較深，其發(fā)酵液的顏色呈紅褐色，色澤光亮，與紅酒的顏色較為相似；所提到的粉末狀色素粗產(chǎn)品的顏色也沒有發(fā)生明顯變化，仍為紅褐色，同時(shí)色素產(chǎn)生相對較快，在4-6天左右。因此，本次實(shí)驗(yàn)主要的研究材料選定為Aua09。

2.色素的溶解性。此色素易溶于堿性溶液。在酸性條件之下，色素溶解程度隨著pH的降低而不斷減少，當(dāng)pH降至2以下時(shí)，色素幾乎完全沉淀。在堿性條件下，隨著pH的不斷升高，其溶液顏色會逐漸變深。色素能夠溶于丙酮、甲醇以及乙醇，但溶解性不明顯；溶解程度最大的是甲醇，其次為乙醇，最后為丙酮，但并不溶于乙醚。

3.色素的光譜特點(diǎn)。（1）色素的紫外可見吸收光譜。稱取色素5mg，溶解以后加入蒸餾水補(bǔ)足到10mL，采取UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。參照物為蒸餾水，選取掃描的波長為300-360nm，色素的吸收峰值最高為304nm。（2）色素的紅外吸收光譜。稱取色素2mg，加入200mg的KBr，干燥處理后混合研磨成粉狀，再壓成透明薄片，400-4000cm-1掃描，在3432.68cm-1發(fā)生吸收峰是由于-OH和-NH2的伸展振動(dòng)所致。

4.色素的穩(wěn)定性。（1）溫度對色素穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同一溫度之下，隨著水浴時(shí)間的進(jìn)一步延長，色素溶液當(dāng)中的吸光度不斷增加；水浴時(shí)間相同，溫度越高，則吸光度就越大。然而在室溫之下放置的色素溶液，在8小時(shí)當(dāng)中的吸光度始終保持不變，這表明色素的熱穩(wěn)定性較好。（2）光對色素穩(wěn)定性的影響。將色素樣品放置在3000Lx的光照強(qiáng)度下分別進(jìn)行照射，結(jié)果顯示，隨著光照時(shí)間的不斷增加，色素溶液的吸光度雖然呈現(xiàn)下降趨勢，但相對較為穩(wěn)定，不過也不宜長時(shí)間在強(qiáng)光之下進(jìn)行照射。（3）pH對色素穩(wěn)定性的影響。隨著pH的進(jìn)一步升高，OD值也呈現(xiàn)明顯升高的趨勢；當(dāng)pH=2時(shí)，色素從紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S棕色，同時(shí)有沉淀析出。這說明酸性越強(qiáng)，溶解度越低。

三、討論

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們的生活水平日益提高，對于食品當(dāng)中應(yīng)用的合成色素是否對人體造成危害也提出了質(zhì)疑。另外，根據(jù)相關(guān)報(bào)道表明，絕大部分的合成色素沒有辦法向人類提供所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，部分合成色素甚至有可能對人體健康造成較大危害。天然色素具有色澤自然、安全以及無毒的優(yōu)勢，所以，對天然食用色素的開發(fā)是未來發(fā)展的趨勢。

黑木耳是一種營養(yǎng)豐富和藥用價(jià)值相對較高的食用真菌，本實(shí)驗(yàn)利用黑木耳發(fā)酵生產(chǎn)天然色素，并從多個(gè)方面對該色素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，該色素的熱穩(wěn)定性相對較好，光穩(wěn)定性也較好，然而不宜在強(qiáng)光之下長期暴露，在堿性條件之下色素顏色進(jìn)一步加深，這表明該色素能夠應(yīng)用在熱加工的食品當(dāng)中。另外，黑木耳的原材料容易得到，提取方式簡便，生產(chǎn)周期相對較短，安全且無毒性，值得進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。該色素的外觀呈紅褐色，對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理作用等也有必要進(jìn)行更加深入的研究。

作者簡介：羅忠國（1982-），男，工程師；主要研究方向：天然色素的開發(fā)及應(yīng)用、飲料的研發(fā)。

*通訊作者：李冬梅（1984-），女，工程師；主要研究方向：天然色素的研發(fā)及應(yīng)用。