歐陽德文,寧亞麗,吳躍
(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室,湖南 長沙 410004)
糙米酒是以糙米為原料,在蒸煮的米飯或熬煮的糙米漿中添加酒曲或者接入多菌種微生物發(fā)酵而成的低酒精度產(chǎn)品,其營養(yǎng)和風味成分較常規(guī)米酒更為豐富,米香濃郁、酒味清爽、柔和適口,富含谷胱甘肽等多種功能性營養(yǎng)成分[1]。但由于其發(fā)酵變化更為復(fù)雜,產(chǎn)品品質(zhì)較難控制,所以一直以來較難形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模。
這些年隨著發(fā)酵等相關(guān)科學(xué)的進一步發(fā)展,國內(nèi)外研究學(xué)者再次關(guān)注糙米酒的研發(fā),其主要是對糙米酒工藝的研究,比如蘇佳佳等[2]利用模糊數(shù)學(xué)感官評價法對糙米酒的制備工藝進行優(yōu)化,并利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(gaschromatography-olfactometry-massspectrometry,GC-O-MS)對其揮發(fā)性成分進行分析,經(jīng)過對比得出糙米酒風味物質(zhì)比糯米酒更加豐富。Kuo等[3]將擠壓膨化處理過的糙米,加入酒曲發(fā)酵,通過與浸泡蒸煮后的糙米制備的糙米酒進行對比,發(fā)現(xiàn)擠壓膨化處理過的糙米制備出的糙米酒,其酒精產(chǎn)量提高了12.4%。Park等[4]用發(fā)芽糙米和辣椒制備糙米酒,發(fā)現(xiàn)添加10%~50%的辣椒較為適宜,其中20%的添加量接受度高,既增加了風味又平衡了口感;辣椒糙米酒中主要揮發(fā)類物質(zhì)為乙酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇。日本早前也有利用糙米為原料,添加乳酸與葡萄酒酵母制成糙米葡萄酒,成品風味酸甜適中,果香宜人[5]。
制作發(fā)酵酒會經(jīng)歷3個主要階段,包括發(fā)酵(fermentation)、后發(fā)酵(postfermentation)和陳化(aging)。對于一些葡萄酒的生產(chǎn),也會將后發(fā)酵和陳化過程合二為一。在糙米酒發(fā)酵過程中,之所以能夠保持一定的酒精度,并產(chǎn)生適宜的風味口感,是因為大量微生物的生理作用,其中主要的微生物種類為霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌等[6]。霉菌、酵母和細菌能產(chǎn)生大量的酶,用于細胞代謝和小分子生成,這些酶也有助于最終產(chǎn)品的風味形成[7]。糙米酒在發(fā)酵和后發(fā)酵過程中,微生物的代謝和生長對糙米酒的風味起到了決定性的作用。新釀造的糙米酒,酯類的香氣成分刺鼻,口感具有一定刺激性,經(jīng)過一定時間低溫后發(fā)酵期,新酒的刺激性氣味方可消失,取而代之的是香氣濃厚、口感清爽。因此短時間低溫后發(fā)酵對糙米酒最終產(chǎn)品品質(zhì)有至關(guān)重要的作用。酒的陳化過程可以促進醇分子之間的締合,也可以促進醇分子與水分子的締合,醇類和酸類的酯化反應(yīng)也會加快[8]。酒的后發(fā)酵與陳化機理類似,主要區(qū)別在于后發(fā)酵中酒精度更低且主要風味物質(zhì)成分的產(chǎn)生和變化主要依賴于微生物的代謝作用。典型的陳化作用是依賴于高酒精度下發(fā)生的一系列化學(xué)變化,這些變化會影響揮發(fā)性化合物和酚類化合物,例如葡萄酒在陳化過程中成分的復(fù)雜性會增加,感官特征也發(fā)生了變化[9-10]。
本文借助高通量測序和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對不同后發(fā)酵期的糙米酒菌種和揮發(fā)性物質(zhì)進行對比研究,確定后發(fā)酵期的優(yōu)勢菌種和具有獨特風味的揮發(fā)性物質(zhì),以及糙米酒最佳后發(fā)酵期,為多菌種發(fā)酵糙米酒提供新的思路和科學(xué)借鑒,也為糙米酒生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。
有機糙米:黑龍江省和糧農(nóng)業(yè)有限公司;霉菌(米根霉、總狀毛霉)、酵母(釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ)、乳酸菌(戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌):中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院A304實驗室在酒曲中篩選所得;DNA抽提試劑盒:美國Omega Bio-Tek公司;2%瓊脂糖凝膠:西班牙biowes公司;FastPfu DNA聚合酶:北京全氏金生物科技公司;DNA片段回收試劑盒:美國Axygen公司;土壤基因組DNA提取試劑盒:美國MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司。
NanoDrop2000超微量分光光度計:美國Thermo Fisher Scientific公司;DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠;ABI GeneAmp?9700型PCR儀:美國ABI公司;Biotek ELx800酶標儀:美國Biotek公司;Illumina Miseq測序儀:美國 Illumina公司;65 μmPDMS/DVB 固相微萃取頭、手動固相微萃取裝置:美國Supelco公司;7890B-7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:安捷倫科技有限公司。
1.3.1 糙米酒樣品制備
稱取一定量的糙米浸泡12 h,米水比為1∶5(質(zhì)量比)置于電飯煲進行熬煮4 h,趁熱分裝至藍蓋瓶中,每瓶分裝100 g米湯混合物。將總狀毛霉和米根霉按3∶2(體積比)的比例接種入瓶內(nèi),總接種量為5%,先在28℃下發(fā)酵2 d;后將釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ4 種酵母菌按 5∶2∶2∶1(體積比)接種入瓶,總接種量為10%,后在28℃下發(fā)酵3 d;再將戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌4種乳酸菌按1∶1∶1∶1(質(zhì)量比)接種入瓶,總接種量為 10%,在 37 ℃發(fā)酵下發(fā)酵2 d。最后樣品置于4℃下分別進入后發(fā)酵期 7、14、18、21、28 d,取不同后發(fā)酵時間的樣品進行菌種和風味物質(zhì)含量測定。
1.3.2 糙米酒樣品總DNA提取及聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增
將后發(fā)酵樣品混勻后,吸取15 mL離心(4 000×g,10 min),收集沉淀在-80℃冷凍備用。
DNA的抽提和PCR擴增:根據(jù)土壤基因組DNA提取試劑盒說明書進行總DNA抽提,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽提質(zhì)量;用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′)對細菌16S的V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增,用引物 ITS1F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對真菌ITS2區(qū)域進行PCR擴增。
擴增反應(yīng)體系(20 μL):5×FastPfu Buffer 4 μL,2.5 mol/L dNTPs 2 μL,DNA 模板 10 ng,DNA 聚合酶0.4 μL,5 μmol/L 上下游引物 0.8 μL,ddH2O 補至 20 μL。
擴增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,48℃退火 30 s,72℃延伸 4 s(30次循環(huán)),最后 72℃延伸10 min。
1.3.3 糙米酒樣品中微生物Illumina Miseq測序
使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用DNA片段回收試劑盒純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測,利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。再將純化后的擴增片段構(gòu)建基因文庫。最后在Miseq PE300平臺進行上機測序,在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。
1.3.4 測序數(shù)據(jù)處理
將原始測序序列優(yōu)化后,使用UPAR SE軟件(version7.1 http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類,利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目分類器(ribosomal database project classifier,R DP classifier)(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列比對細菌SILVA數(shù)據(jù)庫(SSU123)和真菌UNITE數(shù)據(jù)庫進行分類學(xué)注釋。
1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)提取
將65 μm的PDMS/DVB固相微萃取頭在氣相端進樣口于250℃老化至無雜峰,取6mL酒樣置于20mL樣品瓶中,加入2.0 g氯化鈉,壓緊瓶蓋,于60℃磁力攪拌器上10 min,然后將固相微萃?。╯olid phase micro extraction process,SPME)頭插入到樣品瓶中頂空吸附40 min,隨后取出萃取頭,立即插入氣相端進樣口中于250℃解吸2 min。
1.3.6 GC-MS分析
色譜條件:HP-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣 He(純度 5 個 9),流量 1 mL/min,MMI進樣口,直接進樣,進樣口溫度250℃,柱溫:起始溫度40℃,保持2min,以5℃/min升溫至250℃,保持5min。質(zhì)譜條件:接口溫度250℃,離子源溫度230℃,電離方式電子電離源,電子能量70 eV,掃描質(zhì)量范圍40 amu~400 amu,掃描時間300 ms。將 GC-MS檢測的數(shù)據(jù)用MassHunter定性軟件打開,通過軟件自動積分,按質(zhì)譜圖解和NIST14.L譜庫檢索(美國國家標準研究院2014譜庫)對化合物進行卷積和分析(匹配度大于80),并使用面積歸一化法計算各成分相對百分含量。
根據(jù)Barcode標簽將下機數(shù)據(jù)拆分成不同樣品,去除Barcode序列和PCR擴增引物序列。使用FLASH(version 1.2.7)軟件,通過對所有參與拼接的序列進行兩兩對比,計算其序列間的重疊關(guān)系,并對每個樣品的序列進行拼接,得到原始序列標簽數(shù)據(jù)(Raw Tags),再使用Trimmomatic(version 0.33)軟件,對原始序列標簽數(shù)據(jù)進行過濾,得到高質(zhì)量的序列標簽數(shù)據(jù),最后使用UCHME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體,得到最終有效數(shù)據(jù)。
將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME(version 1.8.0)軟件中的UCLUS集群方法在97%的相似度水平下進行OTU聚類,利用 Mothur(version v.1.30)軟件對樣品的 α-多樣性進行評估,并基于細菌SILVA和真菌UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學(xué)注釋,生成不同分類水平上的物種豐度表,再利用Origin繪制樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。
α-多樣性反映了單個樣品內(nèi)部物種的多樣性,指標有 Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Coverage指數(shù)等,通過這些指標可對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估[11-12]。其中,Sobs指數(shù)用來估計群落中的操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)數(shù)目,OTU值是為了便于系統(tǒng)分析,人為給某一個分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標志。通過對樣本序列進行聚類,將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組,每個小組就是一個OTU;Shannon指數(shù)用于衡量群落的異質(zhì)性;Simpson指數(shù)代表隨機取樣的兩個體系屬于不同種的概率,其值越小,代表樣品物種分布越均勻;Ace指數(shù)和Chao指數(shù)越大,群落的豐富度越高;Coverage指數(shù)用來測量通過檢測和測序得到的物種覆蓋率[13],Coverage指數(shù)越高,代表樣品的序列在文庫中檢出的程度越高。在后發(fā)酵期的5個糙米酒樣品共獲得細菌優(yōu)化序列227 207條,共聚合了108個OTU,真菌優(yōu)化序列357 823條,共聚合了33個OTU。
所有樣品的α-多樣性指數(shù)如表1所示。
表1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品的微生物α-多樣性指數(shù)Table 1 Microbial α-diversity index of brown rice wine at different postfermentation stages
由表1可知,不同后發(fā)酵期樣品中真菌和細菌α-多樣性均存在明顯波動。其中,后發(fā)酵18 d樣品中真菌Sobs、Shannon、Ace和 Chao指數(shù)均最大,而 Simpson指數(shù)最小,說明后發(fā)酵18 d樣本的真菌群落物種豐富度、生物多樣性和物種的均勻程度都是最好。與真菌相同,細菌的最大Sobs值也出現(xiàn)在18 d。有區(qū)別的是,細菌最大Shannon、Ace和Chao指數(shù)出現(xiàn)在14 d,而最小的Simpson指數(shù)出現(xiàn)在21 d??傮w來說,細菌和真菌群落的Coverage指數(shù)都大于0.9,證明樣品中的序列基本能在文庫中檢出,樣本的測序結(jié)果也更具分析價值。后發(fā)酵期的樣品中真菌的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)不斷在波動,但總體是不斷向微生物多樣性更高和分布更均勻方向波動的。但樣品的細菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是先升后降和先降后升,代表細菌的微生物多樣性和物種豐富度是先升后降的,與真菌有所區(qū)別。
不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內(nèi)真菌菌種在門、屬、種水平下的結(jié)構(gòu)分布見圖1。
圖1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品真菌門、屬、種水平下結(jié)構(gòu)分布Fig.1 Fungal structure of phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages
由圖1中門水平下真菌相對豐度可知,真菌隸屬的兩個門分別為子囊菌門(Ascomycota)和毛菌亞門(Mucromycota),發(fā)酵最初接種的霉菌米根霉和總狀毛霉均隸屬于毛菌亞門,發(fā)酵接種的酵母菌屬于子囊菌門,其中子囊菌門在所有樣品的平均豐度值最高,為99%左右,而毛菌亞門豐度值在0.6%~1.07%之間波動,說明子囊菌門在糙米酒后發(fā)酵期的真菌菌種結(jié)構(gòu)占有重要地位,為絕對優(yōu)勢菌種。在屬水平下,圖中給出了豐度前3的菌種,其他豐度占比較小的均合并在其它類。如圖1所示,糙米酒中主要真菌菌種有酵母屬(Saccharomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)和毛霉屬(Mucor),其中酵母屬占絕對優(yōu)勢地位為93.90%左右,在28 d后發(fā)酵期畢赤氏酵母屬相對豐度從3%提升到了11%,提高近4倍;毛霉屬在糙米酒中后發(fā)酵初期含量為8.32%,而隨著糙米酒后發(fā)酵的進行,毛霉屬14 d時豐度低至0.8%左右,且后期一直保持不變。總體而言,酵母屬在整個后發(fā)酵階段都占有絕對主導(dǎo)地位,畢赤氏酵母屬在后發(fā)酵第28天相對豐度較前期呈波動性增加,毛霉屬處于低水平。
在種水平下,主要的真菌菌種為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、未分類畢赤氏酵母屬菌種(Unclassified pichia)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。其中,釀酒酵母菌為絕對優(yōu)勢菌種,平均豐度達到了93.90%。而隨著后發(fā)酵的延長,畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度呈現(xiàn)增加趨勢,在后發(fā)酵第28天時,未分類畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度增長了4倍左右,達到了11.47%。而卷枝毛霉在后發(fā)酵期的14 d豐度顯著降低,后一直保持不變,可能是由于釀酒酵母的生長抑制了卷枝毛霉的活性,后發(fā)酵期的風味變化應(yīng)該主要取決于真菌中的酵母。釀酒酵母除了會將原料中的糖轉(zhuǎn)化為酒精外,還能將原料中的氨基酸等前體物質(zhì)轉(zhuǎn)換為酯、酸、高級醇等風味物質(zhì)[14]。但有研究表明,釀酒酵母會抑制產(chǎn)香酵母的生長,產(chǎn)香酵母也會抑制釀酒酵母的發(fā)酵能力,通常認為是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物造成了產(chǎn)香酵母生長的不利條件,包括產(chǎn)酸與乙醇,同時高密度的細胞也對產(chǎn)香酵母的增殖造成了消極影響,但是兩者混合發(fā)酵時總體的發(fā)酵水平下降不多,但乙酸乙酯等風味物質(zhì)卻大幅增加[15-16]。但根據(jù)研究結(jié)果,二者在分批接種發(fā)酵時,前期釀酒酵母占優(yōu)勢菌種地位,畢赤酵母屬在前5 d未發(fā)現(xiàn),在6、7 d增加,增加至5.21%,到了后發(fā)酵期,釀酒酵母仍是主要優(yōu)勢菌種,畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度也略有增加。釀酒酵母在酒類產(chǎn)品的應(yīng)用十分廣泛,不同菌株的組合還能使釀酒酵母的代謝發(fā)生變化,如釀酒酵母與植物乳桿菌和Oenococcus oeni菌株組合還對蘋果酸消耗和代謝物生產(chǎn)有影響[17]。
不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內(nèi)細菌菌種在門、屬、種水平下的結(jié)構(gòu)分布見圖2。
圖2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品細菌門、屬、種水平下結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Bacterial structure of different phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages
由圖2中門水平下細菌相對豐度可知,主要細菌優(yōu)勢菌門分別是厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria),發(fā)酵最初接種的細菌為1株戊糖片球菌、2株干酪乳桿菌和1株短乳桿菌均隸屬于厚壁菌門,且厚壁菌門是米酒后發(fā)酵期的絕對優(yōu)勢菌種,平均相對豐度達到了97.90%,而變形菌門是污染的外來菌種相對豐度由最初的0.029%升至第14天的6.50%,第18天急劇下降至0.6%,到后發(fā)酵21 d幾乎不能被檢出。在屬水平下,糙米酒中后發(fā)酵期主要細菌菌屬為發(fā)酵時添加的乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)以及外來污染的寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。其中整個后發(fā)酵期的乳桿菌屬是絕對優(yōu)勢細菌種,而且在糙米酒發(fā)酵過程中,乳桿菌屬也是優(yōu)勢菌種,有研究表明其與米酒的酸度高度相關(guān),是發(fā)酵中產(chǎn)生酸的關(guān)鍵細菌[18]。而發(fā)酵添加的片球菌屬從發(fā)酵結(jié)束一直到整個后發(fā)酵期的豐度極低,最高值是21 d的1.40%。后發(fā)酵第14天,寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬的相對豐度達到最高,分別平均為2.14%和1.48%,但在后期驟然遞減至幾乎沒有,可能是由于寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬都屬于專性需氧菌,后發(fā)酵過程中,體系氧氣不斷被消耗,二者豐度降低。也有研究表明,假單胞菌減少的原因可能是它不能發(fā)酵葡萄糖,所以后發(fā)酵的后期糖源減少時假單胞菌屬相對豐度也隨之減少[19]。
在種水平下,主要細菌菌種為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、彎曲假單胞菌(Pseudomonas geniculata)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其中,發(fā)酵時添加的干酪乳桿菌在后熟期相對豐度一直處于80%以上,為絕對優(yōu)勢菌種。有研究表明,在利用固定化釀酒酵母生產(chǎn)葡萄酒時,通過添加固定化的干酪乳桿菌使得葡萄酒中的蘋果酸降解,乙酸乙酯濃度顯著增加[20]。干酪乳桿菌在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用十分廣泛,可發(fā)酵產(chǎn)生有機酸、細菌素等多種抑菌物質(zhì)[21],還可能對改善腸道健康有所幫助。
發(fā)酵時添加的短乳桿菌在后發(fā)酵期豐度存在明顯波動,由0 d的5.77%增長至18 d的18.20%,但在21 d時顯著降回了8.88%,且戊糖片球菌在發(fā)酵結(jié)束后和整個后發(fā)酵期豐度極低,最高值出現(xiàn)在21 d為1.4%,說明可能是其它菌種創(chuàng)造出不利于戊糖片球菌生長的環(huán)境,或是其它乳酸菌產(chǎn)生的細菌素對其生長產(chǎn)生了抑制作用[22]。
作為雜菌的彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌在發(fā)酵結(jié)束后,其豐度極低幾乎檢測不到,但隨著后發(fā)酵期的延長,在第14天時二者豐度明顯增加達到最大,分別為2.94%和2.26%。但到后發(fā)酵第18天,二者豐度驟減,與屬水平下豐度變化相似,可能是由于后發(fā)酵過程中氧氣消耗或是由于不能利用糖源,使得這兩類專性好氧菌數(shù)量減少。后發(fā)酵期第7天時能檢測到外來細菌,此后幾乎檢測不到,細菌多樣性的結(jié)果說明,污染的外來細菌在適當?shù)暮蟀l(fā)酵期內(nèi)自然被抑制,說明選擇合適的后發(fā)酵期可以避免雜菌的滋生,有利于產(chǎn)品安全。
糙米酒后發(fā)酵期揮發(fā)性風味物質(zhì)變化見表2。
表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %
續(xù)表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)Continue table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %
如表2所示,利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析糙米酒后發(fā)酵階段樣品共檢測出45種揮發(fā)性物質(zhì),其中相含量最高、種類最多的化合物是酯類,其次是醇類,最后分別是酮類和酚類。
酯類物質(zhì)主要有11種,包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、松香酸乙酯、硬脂酸乙酯、琥珀酸二乙酯、異氰酸甲酯,這些化合物大部分屬于乙酯類,說明乙酯類化合物在揮發(fā)性物質(zhì)組成上占有十分重要的地位。相對含量最高的棕櫚酸乙酯在后發(fā)酵階段的含量先降后升,0~14 d由33.06%降至 26.90%,14 d~28 d增加至33.38%;亞油酸乙酯0~7 d在6~7%之間波動,后發(fā)酵第28天為12.36%;油酸乙酯僅存在于后發(fā)酵第7天和第21天樣品中,相對含量分別為4.38%和4.39%。棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯通常被稱為白酒中三大高級脂肪酸酯,廣泛存在白酒中,能使酒體變得清甜醇香、舒適優(yōu)雅[23]。其中,棕櫚酸乙酯普遍含量最高,與本研究結(jié)果一致,其具有微弱蠟香、奶油香氣,可以增加酒體的醇厚感,降低酒的澀味,增加余味。癸酸乙酯具有椰子香型香氣,其相對含量在后發(fā)酵期內(nèi)先增加后降低,峰值出現(xiàn)在第18天樣品中,為10.29%。具有花果香氣的月桂酸乙酯也呈現(xiàn)波動性變化,峰值同樣出現(xiàn)在第18天樣品中,為6.36%。同樣具有水果香氣的辛酸乙酯的峰值也出現(xiàn)第18天的樣品中。香氣分值(odour threshold values in air,OVA)代表了復(fù)合濃度與其感官檢測閾值的比值,有研究表明,在白酒和櫻桃酒中辛酸乙酯與癸酸乙酯的香氣分值較大,呈香也較為明顯,表現(xiàn)出這兩種酯對整體香氣的貢獻度較高[24-25]。酯類化合物能提供水果味和花香味,且隨著酯類物質(zhì)碳原子的增加,水解速率常數(shù)降低,酯類化合物也愈發(fā)穩(wěn)定[26],而檢測出的酯類物質(zhì)碳原子都在8個及以上,都相對不容易水解。另外,有研究報道,發(fā)酵酒包括米酒、黃酒中會廣泛產(chǎn)生一種致癌物氨基甲酸乙酯(ethyl carbonate,EC)[27],是米酒釀造過程中主要通過尿素與乙醇的自發(fā)反應(yīng)而產(chǎn)生,在本研究中未檢測到此揮發(fā)性酯類物質(zhì)。
糙米酒后發(fā)酵樣品中醇類物質(zhì)主要有β-苯乙醇、正癸醇、2-甲基-1-丁醇。其中,β-苯乙醇在樣品中普遍相對含量最高為13.84%~23.94%,峰值出現(xiàn)在第14天的樣品中。正癸醇的最高和最低相對含量分別為1.23%、0.37%。而2-甲基-1-丁醇在后發(fā)酵的14 d出現(xiàn),相對含量為8.55%,此后又消失。β-苯乙醇是白酒、黃酒、葡萄酒、米酒等各類酒類中重要的風味物質(zhì),是老白干水溶性組分中香氣貢獻最大的香氣物質(zhì),具有優(yōu)雅、醇香的玫瑰花香味還是其他風味物質(zhì)的前體物質(zhì)[28]。β-苯乙醇主要是由酵母菌生長代謝合成,可以由不同的產(chǎn)香菌株合成,其中有多種酵母具有合成β-苯乙醇能力,如釀酒酵母、畢赤酵母和異常漢遜酵母等,有研究表明,畢赤酵母可以通過艾氏途徑生成β-苯乙醇且對于β-苯乙醇的產(chǎn)生能力最為優(yōu)秀,還可以生成己酸乙酯等一系列風味物質(zhì)[29]。正癸醇通常也存在于黃酒、白酒、葡萄酒等各種發(fā)酵酒中,略有玫瑰和橙花氣味。醇類物質(zhì)在酒類風味中占重要的地位,是酒的助香劑,也是形成其他香類物質(zhì)的前體,雖然含量少,但是為酒提供了十足的風味。
酮類和酚類揮發(fā)性物質(zhì)在糙米酒中含量比較低,且大多數(shù)在整個后發(fā)酵階段并非一直存在。2,2,3-三甲基環(huán)丁酮在后發(fā)酵第0天樣品中出現(xiàn)為8.89%,此后未檢測出。甲基乙烯基酮含量在第7天樣品中出現(xiàn)為8.21%,此后也未檢測出。甲基酮具有成熟奶酪特有的香味,可由脂肪酸通過酶氧化脫羧(β-氧化)形成。因此,糙米中大量的脂肪酸可能是發(fā)酵糙米樣品中甲基酮產(chǎn)量增加的原因[30]。2,5-二叔丁酚在后發(fā)酵期第18天至第28天出現(xiàn),相對含量均在1.0%左右。
酒的香氣特征是決定其質(zhì)量和價值的重要指標,揮發(fā)性特征和感官特性影響了消費者對酒的偏好[31]。從結(jié)果可知,隨糙米酒后發(fā)酵時間的延長,酯類和醇類是其主要的香氣成分。酯類物質(zhì)相對含量在60%~80%左右變化,醇類物質(zhì)相對含量在15%~30%左右變化,其中棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯對糙米酒香味貢獻較大。同時結(jié)合感官評價認為,在后發(fā)酵期第18天為本研究下的最佳后發(fā)酵期,其糙米酒樣品,其口感清爽、香氣濃郁并適合飲用。
通過分批接種霉菌、酵母和乳酸菌發(fā)酵而成的糙米酒,在后發(fā)酵過程中占主導(dǎo)地位的是酵母和細菌,其中絕對優(yōu)勢菌種分別為釀酒酵母菌和干酪乳桿菌。在后發(fā)酵過程中發(fā)生的物理化學(xué)變化以及產(chǎn)生的風味物質(zhì)都可能與這些菌種相關(guān),這些菌種對糙米酒的風味和品質(zhì)起到了至關(guān)重要的作用,而畢赤酵母是酒品中主要的產(chǎn)香和產(chǎn)酯酵母,為主要提供糙米酒風味的一類菌種。后發(fā)酵期內(nèi)也出現(xiàn)了彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌雜菌,但隨著后發(fā)酵的進程又出現(xiàn)消失的可能,因此,合適的后發(fā)酵期也有利于避免雜菌的滋生。糙米酒后發(fā)酵時主要風味物質(zhì)為棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯。通過整體的風味分析并結(jié)合感官評價可知,糙米酒后發(fā)酵期為18 d時風味最優(yōu),無明顯雜菌生長,被認為是最佳后發(fā)酵期。這些結(jié)果對指導(dǎo)糙米酒的工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā),增強糙米酒酒香和風味提供了借鑒性數(shù)據(jù),為開發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良,口感豐富的糙米酒提供了理論支撐。