歐陽(yáng)德文，寧亞麗，吳躍

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)品深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

糙米酒是以糙米為原料，在蒸煮的米飯或熬煮的糙米漿中添加酒曲或者接入多菌種微生物發(fā)酵而成的低酒精度產(chǎn)品，其營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味成分較常規(guī)米酒更為豐富，米香濃郁、酒味清爽、柔和適口，富含谷胱甘肽等多種功能性營(yíng)養(yǎng)成分[1]。但由于其發(fā)酵變化更為復(fù)雜，產(chǎn)品品質(zhì)較難控制，所以一直以來(lái)較難形成產(chǎn)業(yè)規(guī)模。

這些年隨著發(fā)酵等相關(guān)科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者再次關(guān)注糙米酒的研發(fā)，其主要是對(duì)糙米酒工藝的研究，比如蘇佳佳等[2]利用模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)法對(duì)糙米酒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gaschromatography-olfactometry-massspectrometry，GC-O-MS）對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)對(duì)比得出糙米酒風(fēng)味物質(zhì)比糯米酒更加豐富。Kuo等[3]將擠壓膨化處理過(guò)的糙米，加入酒曲發(fā)酵，通過(guò)與浸泡蒸煮后的糙米制備的糙米酒進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)擠壓膨化處理過(guò)的糙米制備出的糙米酒，其酒精產(chǎn)量提高了12.4%。Park等[4]用發(fā)芽糙米和辣椒制備糙米酒，發(fā)現(xiàn)添加10%～50%的辣椒較為適宜，其中20%的添加量接受度高，既增加了風(fēng)味又平衡了口感；辣椒糙米酒中主要揮發(fā)類(lèi)物質(zhì)為乙酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇。日本早前也有利用糙米為原料，添加乳酸與葡萄酒酵母制成糙米葡萄酒，成品風(fēng)味酸甜適中，果香宜人[5]。

制作發(fā)酵酒會(huì)經(jīng)歷3個(gè)主要階段，包括發(fā)酵（fermentation）、后發(fā)酵（postfermentation）和陳化（aging）。對(duì)于一些葡萄酒的生產(chǎn)，也會(huì)將后發(fā)酵和陳化過(guò)程合二為一。在糙米酒發(fā)酵過(guò)程中，之所以能夠保持一定的酒精度，并產(chǎn)生適宜的風(fēng)味口感，是因?yàn)榇罅课⑸锏纳碜饔?，其中主要的微生物種類(lèi)為霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌等[6]。霉菌、酵母和細(xì)菌能產(chǎn)生大量的酶，用于細(xì)胞代謝和小分子生成，這些酶也有助于最終產(chǎn)品的風(fēng)味形成[7]。糙米酒在發(fā)酵和后發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝和生長(zhǎng)對(duì)糙米酒的風(fēng)味起到了決定性的作用。新釀造的糙米酒，酯類(lèi)的香氣成分刺鼻，口感具有一定刺激性，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間低溫后發(fā)酵期，新酒的刺激性氣味方可消失，取而代之的是香氣濃厚、口感清爽。因此短時(shí)間低溫后發(fā)酵對(duì)糙米酒最終產(chǎn)品品質(zhì)有至關(guān)重要的作用。酒的陳化過(guò)程可以促進(jìn)醇分子之間的締合，也可以促進(jìn)醇分子與水分子的締合，醇類(lèi)和酸類(lèi)的酯化反應(yīng)也會(huì)加快[8]。酒的后發(fā)酵與陳化機(jī)理類(lèi)似，主要區(qū)別在于后發(fā)酵中酒精度更低且主要風(fēng)味物質(zhì)成分的產(chǎn)生和變化主要依賴(lài)于微生物的代謝作用。典型的陳化作用是依賴(lài)于高酒精度下發(fā)生的一系列化學(xué)變化，這些變化會(huì)影響揮發(fā)性化合物和酚類(lèi)化合物，例如葡萄酒在陳化過(guò)程中成分的復(fù)雜性會(huì)增加，感官特征也發(fā)生了變化[9-10]。

本文借助高通量測(cè)序和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)不同后發(fā)酵期的糙米酒菌種和揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究，確定后發(fā)酵期的優(yōu)勢(shì)菌種和具有獨(dú)特風(fēng)味的揮發(fā)性物質(zhì)，以及糙米酒最佳后發(fā)酵期，為多菌種發(fā)酵糙米酒提供新的思路和科學(xué)借鑒，也為糙米酒生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機(jī)糙米：黑龍江省和糧農(nóng)業(yè)有限公司；霉菌（米根霉、總狀毛霉）、酵母（釀酒酵母、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ）、乳酸菌（戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌）：中南林業(yè)科技大學(xué)食品學(xué)院A304實(shí)驗(yàn)室在酒曲中篩選所得；DNA抽提試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司；2%瓊脂糖凝膠：西班牙biowes公司；FastPfu DNA聚合酶：北京全氏金生物科技公司；DNA片段回收試劑盒：美國(guó)Axygen公司；土壤基因組DNA提取試劑盒：美國(guó)MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠(chǎng)；ABI GeneAmp?9700型PCR儀：美國(guó)ABI公司；Biotek ELx800酶標(biāo)儀：美國(guó)Biotek公司；Illumina Miseq測(cè)序儀：美國(guó) Illumina公司；65 μmPDMS/DVB 固相微萃取頭、手動(dòng)固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司；7890B-7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米酒樣品制備

稱(chēng)取一定量的糙米浸泡12 h，米水比為1∶5（質(zhì)量比）置于電飯煲進(jìn)行熬煮4 h，趁熱分裝至藍(lán)蓋瓶中，每瓶分裝100 g米湯混合物。將總狀毛霉和米根霉按3∶2（體積比）的比例接種入瓶?jī)?nèi)，總接種量為5%，先在28℃下發(fā)酵2 d；后將釀酒酵母、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ4 種酵母菌按 5∶2∶2∶1（體積比）接種入瓶，總接種量為10%，后在28℃下發(fā)酵3 d；再將戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌4種乳酸菌按1∶1∶1∶1（質(zhì)量比）接種入瓶，總接種量為 10%，在 37 ℃發(fā)酵下發(fā)酵2 d。最后樣品置于4℃下分別進(jìn)入后發(fā)酵期 7、14、18、21、28 d，取不同后發(fā)酵時(shí)間的樣品進(jìn)行菌種和風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定。

1.3.2 糙米酒樣品總DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

將后發(fā)酵樣品混勻后，吸取15 mL離心（4 000×g，10 min），收集沉淀在-80℃冷凍備用。

DNA的抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)土壤基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA抽提質(zhì)量；用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′）對(duì)細(xì)菌16S的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用引物 ITS1F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)真菌ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，DNA 模板 10 ng，DNA 聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 上下游引物 0.8 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，48℃退火 30 s，72℃延伸 4 s（30次循環(huán)），最后 72℃延伸10 min。

1.3.3 糙米酒樣品中微生物Illumina Miseq測(cè)序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA片段回收試劑盒純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，利用QuantiFluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。再將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建基因文庫(kù)。最后在Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將原始測(cè)序序列優(yōu)化后，使用UPAR SE軟件（version7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)，利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目分類(lèi)器（ribosomal database project classifier，R DP classifier）（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列比對(duì)細(xì)菌SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123）和真菌UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。

1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)提取

將65 μm的PDMS/DVB固相微萃取頭在氣相端進(jìn)樣口于250℃老化至無(wú)雜峰，取6mL酒樣置于20mL樣品瓶中，加入2.0 g氯化鈉，壓緊瓶蓋，于60℃磁力攪拌器上10 min，然后將固相微萃?。╯olid phase micro extraction process，SPME）頭插入到樣品瓶中頂空吸附40 min，隨后取出萃取頭，立即插入氣相端進(jìn)樣口中于250℃解吸2 min。

1.3.6 GC-MS分析

色譜條件：HP-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣 He（純度 5 個(gè) 9），流量 1 mL/min，MMI進(jìn)樣口，直接進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫：起始溫度40℃，保持2min，以5℃/min升溫至250℃，保持5min。質(zhì)譜條件：接口溫度250℃，離子源溫度230℃，電離方式電子電離源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍40 amu～400 amu，掃描時(shí)間300 ms。將 GC-MS檢測(cè)的數(shù)據(jù)用MassHunter定性軟件打開(kāi)，通過(guò)軟件自動(dòng)積分，按質(zhì)譜圖解和NIST14.L譜庫(kù)檢索（美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研究院2014譜庫(kù)）對(duì)化合物進(jìn)行卷積和分析（匹配度大于80），并使用面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode標(biāo)簽將下機(jī)數(shù)據(jù)拆分成不同樣品，去除Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列。使用FLASH（version 1.2.7）軟件，通過(guò)對(duì)所有參與拼接的序列進(jìn)行兩兩對(duì)比，計(jì)算其序列間的重疊關(guān)系，并對(duì)每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接，得到原始序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)（Raw Tags），再使用Trimmomatic（version 0.33）軟件，對(duì)原始序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)，最后使用UCHME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體，得到最終有效數(shù)據(jù)。

將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUS集群方法在97%的相似度水平下進(jìn)行OTU聚類(lèi)，利用 Mothur（version v.1.30）軟件對(duì)樣品的 α-多樣性進(jìn)行評(píng)估，并基于細(xì)菌SILVA和真菌UNITE分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋?zhuān)刹煌诸?lèi)水平上的物種豐度表，再利用Origin繪制樣品各分類(lèi)學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

α-多樣性反映了單個(gè)樣品內(nèi)部物種的多樣性，指標(biāo)有 Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Coverage指數(shù)等，通過(guò)這些指標(biāo)可對(duì)樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估[11-12]。其中，Sobs指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落中的操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）數(shù)目，OTU值是為了便于系統(tǒng)分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過(guò)對(duì)樣本序列進(jìn)行聚類(lèi)，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，每個(gè)小組就是一個(gè)OTU；Shannon指數(shù)用于衡量群落的異質(zhì)性；Simpson指數(shù)代表隨機(jī)取樣的兩個(gè)體系屬于不同種的概率，其值越小，代表樣品物種分布越均勻；Ace指數(shù)和Chao指數(shù)越大，群落的豐富度越高；Coverage指數(shù)用來(lái)測(cè)量通過(guò)檢測(cè)和測(cè)序得到的物種覆蓋率[13]，Coverage指數(shù)越高，代表樣品的序列在文庫(kù)中檢出的程度越高。在后發(fā)酵期的5個(gè)糙米酒樣品共獲得細(xì)菌優(yōu)化序列227 207條，共聚合了108個(gè)OTU，真菌優(yōu)化序列357 823條，共聚合了33個(gè)OTU。

所有樣品的α-多樣性指數(shù)如表1所示。

表1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品的微生物α-多樣性指數(shù)Table 1 Microbial α-diversity index of brown rice wine at different postfermentation stages

由表1可知，不同后發(fā)酵期樣品中真菌和細(xì)菌α-多樣性均存在明顯波動(dòng)。其中，后發(fā)酵18 d樣品中真菌Sobs、Shannon、Ace和 Chao指數(shù)均最大，而 Simpson指數(shù)最小，說(shuō)明后發(fā)酵18 d樣本的真菌群落物種豐富度、生物多樣性和物種的均勻程度都是最好。與真菌相同，細(xì)菌的最大Sobs值也出現(xiàn)在18 d。有區(qū)別的是，細(xì)菌最大Shannon、Ace和Chao指數(shù)出現(xiàn)在14 d，而最小的Simpson指數(shù)出現(xiàn)在21 d。總體來(lái)說(shuō)，細(xì)菌和真菌群落的Coverage指數(shù)都大于0.9，證明樣品中的序列基本能在文庫(kù)中檢出，樣本的測(cè)序結(jié)果也更具分析價(jià)值。后發(fā)酵期的樣品中真菌的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)不斷在波動(dòng)，但總體是不斷向微生物多樣性更高和分布更均勻方向波動(dòng)的。但樣品的細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是先升后降和先降后升，代表細(xì)菌的微生物多樣性和物種豐富度是先升后降的，與真菌有所區(qū)別。

2.2 糙米酒后發(fā)酵期真菌菌種演替

不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內(nèi)真菌菌種在門(mén)、屬、種水平下的結(jié)構(gòu)分布見(jiàn)圖1。

圖1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品真菌門(mén)、屬、種水平下結(jié)構(gòu)分布Fig.1 Fungal structure of phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages

由圖1中門(mén)水平下真菌相對(duì)豐度可知，真菌隸屬的兩個(gè)門(mén)分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）和毛菌亞門(mén)（Mucromycota），發(fā)酵最初接種的霉菌米根霉和總狀毛霉均隸屬于毛菌亞門(mén)，發(fā)酵接種的酵母菌屬于子囊菌門(mén)，其中子囊菌門(mén)在所有樣品的平均豐度值最高，為99%左右，而毛菌亞門(mén)豐度值在0.6%～1.07%之間波動(dòng)，說(shuō)明子囊菌門(mén)在糙米酒后發(fā)酵期的真菌菌種結(jié)構(gòu)占有重要地位，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種。在屬水平下，圖中給出了豐度前3的菌種，其他豐度占比較小的均合并在其它類(lèi)。如圖1所示，糙米酒中主要真菌菌種有酵母屬（Saccharomyces）、畢赤氏酵母屬（Pichia）和毛霉屬（Mucor），其中酵母屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位為93.90%左右，在28 d后發(fā)酵期畢赤氏酵母屬相對(duì)豐度從3%提升到了11%，提高近4倍；毛霉屬在糙米酒中后發(fā)酵初期含量為8.32%，而隨著糙米酒后發(fā)酵的進(jìn)行，毛霉屬14 d時(shí)豐度低至0.8%左右，且后期一直保持不變?？傮w而言，酵母屬在整個(gè)后發(fā)酵階段都占有絕對(duì)主導(dǎo)地位，畢赤氏酵母屬在后發(fā)酵第28天相對(duì)豐度較前期呈波動(dòng)性增加，毛霉屬處于低水平。

在種水平下，主要的真菌菌種為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、未分類(lèi)畢赤氏酵母屬菌種（Unclassified pichia）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。其中，釀酒酵母菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，平均豐度達(dá)到了93.90%。而隨著后發(fā)酵的延長(zhǎng)，畢赤氏酵母屬菌種的相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在后發(fā)酵第28天時(shí)，未分類(lèi)畢赤氏酵母屬菌種的相對(duì)豐度增長(zhǎng)了4倍左右，達(dá)到了11.47%。而卷枝毛霉在后發(fā)酵期的14 d豐度顯著降低，后一直保持不變，可能是由于釀酒酵母的生長(zhǎng)抑制了卷枝毛霉的活性，后發(fā)酵期的風(fēng)味變化應(yīng)該主要取決于真菌中的酵母。釀酒酵母除了會(huì)將原料中的糖轉(zhuǎn)化為酒精外，還能將原料中的氨基酸等前體物質(zhì)轉(zhuǎn)換為酯、酸、高級(jí)醇等風(fēng)味物質(zhì)[14]。但有研究表明，釀酒酵母會(huì)抑制產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)，產(chǎn)香酵母也會(huì)抑制釀酒酵母的發(fā)酵能力，通常認(rèn)為是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物造成了產(chǎn)香酵母生長(zhǎng)的不利條件，包括產(chǎn)酸與乙醇，同時(shí)高密度的細(xì)胞也對(duì)產(chǎn)香酵母的增殖造成了消極影響，但是兩者混合發(fā)酵時(shí)總體的發(fā)酵水平下降不多，但乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)卻大幅增加[15-16]。但根據(jù)研究結(jié)果，二者在分批接種發(fā)酵時(shí)，前期釀酒酵母占優(yōu)勢(shì)菌種地位，畢赤酵母屬在前5 d未發(fā)現(xiàn)，在6、7 d增加，增加至5.21%，到了后發(fā)酵期，釀酒酵母仍是主要優(yōu)勢(shì)菌種，畢赤氏酵母屬菌種的相對(duì)豐度也略有增加。釀酒酵母在酒類(lèi)產(chǎn)品的應(yīng)用十分廣泛，不同菌株的組合還能使釀酒酵母的代謝發(fā)生變化，如釀酒酵母與植物乳桿菌和Oenococcus oeni菌株組合還對(duì)蘋(píng)果酸消耗和代謝物生產(chǎn)有影響[17]。

2.3 糙米酒后發(fā)酵期細(xì)菌菌種演替

不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內(nèi)細(xì)菌菌種在門(mén)、屬、種水平下的結(jié)構(gòu)分布見(jiàn)圖2。

圖2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品細(xì)菌門(mén)、屬、種水平下結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Bacterial structure of different phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages

由圖2中門(mén)水平下細(xì)菌相對(duì)豐度可知，主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），發(fā)酵最初接種的細(xì)菌為1株戊糖片球菌、2株干酪乳桿菌和1株短乳桿菌均隸屬于厚壁菌門(mén)，且厚壁菌門(mén)是米酒后發(fā)酵期的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，平均相對(duì)豐度達(dá)到了97.90%，而變形菌門(mén)是污染的外來(lái)菌種相對(duì)豐度由最初的0.029%升至第14天的6.50%，第18天急劇下降至0.6%，到后發(fā)酵21 d幾乎不能被檢出。在屬水平下，糙米酒中后發(fā)酵期主要細(xì)菌菌屬為發(fā)酵時(shí)添加的乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）以及外來(lái)污染的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中整個(gè)后發(fā)酵期的乳桿菌屬是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種，而且在糙米酒發(fā)酵過(guò)程中，乳桿菌屬也是優(yōu)勢(shì)菌種，有研究表明其與米酒的酸度高度相關(guān)，是發(fā)酵中產(chǎn)生酸的關(guān)鍵細(xì)菌[18]。而發(fā)酵添加的片球菌屬?gòu)陌l(fā)酵結(jié)束一直到整個(gè)后發(fā)酵期的豐度極低，最高值是21 d的1.40%。后發(fā)酵第14天，寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬的相對(duì)豐度達(dá)到最高，分別平均為2.14%和1.48%，但在后期驟然遞減至幾乎沒(méi)有，可能是由于寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬都屬于專(zhuān)性需氧菌，后發(fā)酵過(guò)程中，體系氧氣不斷被消耗，二者豐度降低。也有研究表明，假單胞菌減少的原因可能是它不能發(fā)酵葡萄糖，所以后發(fā)酵的后期糖源減少時(shí)假單胞菌屬相對(duì)豐度也隨之減少[19]。

在種水平下，主要細(xì)菌菌種為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、彎曲假單胞菌（Pseudomonas geniculata）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。其中，發(fā)酵時(shí)添加的干酪乳桿菌在后熟期相對(duì)豐度一直處于80%以上，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種。有研究表明，在利用固定化釀酒酵母生產(chǎn)葡萄酒時(shí)，通過(guò)添加固定化的干酪乳桿菌使得葡萄酒中的蘋(píng)果酸降解，乙酸乙酯濃度顯著增加[20]。干酪乳桿菌在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用十分廣泛，可發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等多種抑菌物質(zhì)[21]，還可能對(duì)改善腸道健康有所幫助。

發(fā)酵時(shí)添加的短乳桿菌在后發(fā)酵期豐度存在明顯波動(dòng)，由0 d的5.77%增長(zhǎng)至18 d的18.20%，但在21 d時(shí)顯著降回了8.88%，且戊糖片球菌在發(fā)酵結(jié)束后和整個(gè)后發(fā)酵期豐度極低，最高值出現(xiàn)在21 d為1.4%，說(shuō)明可能是其它菌種創(chuàng)造出不利于戊糖片球菌生長(zhǎng)的環(huán)境，或是其它乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用[22]。

作為雜菌的彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌在發(fā)酵結(jié)束后，其豐度極低幾乎檢測(cè)不到，但隨著后發(fā)酵期的延長(zhǎng)，在第14天時(shí)二者豐度明顯增加達(dá)到最大，分別為2.94%和2.26%。但到后發(fā)酵第18天，二者豐度驟減，與屬水平下豐度變化相似，可能是由于后發(fā)酵過(guò)程中氧氣消耗或是由于不能利用糖源，使得這兩類(lèi)專(zhuān)性好氧菌數(shù)量減少。后發(fā)酵期第7天時(shí)能檢測(cè)到外來(lái)細(xì)菌，此后幾乎檢測(cè)不到，細(xì)菌多樣性的結(jié)果說(shuō)明，污染的外來(lái)細(xì)菌在適當(dāng)?shù)暮蟀l(fā)酵期內(nèi)自然被抑制，說(shuō)明選擇合適的后發(fā)酵期可以避免雜菌的滋生，有利于產(chǎn)品安全。

2.4 糙米酒后發(fā)酵期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

糙米酒后發(fā)酵期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化見(jiàn)表2。

表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %

續(xù)表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Continue table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %

如表2所示，利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析糙米酒后發(fā)酵階段樣品共檢測(cè)出45種揮發(fā)性物質(zhì)，其中相含量最高、種類(lèi)最多的化合物是酯類(lèi)，其次是醇類(lèi)，最后分別是酮類(lèi)和酚類(lèi)。

酯類(lèi)物質(zhì)主要有11種，包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、松香酸乙酯、硬脂酸乙酯、琥珀酸二乙酯、異氰酸甲酯，這些化合物大部分屬于乙酯類(lèi)，說(shuō)明乙酯類(lèi)化合物在揮發(fā)性物質(zhì)組成上占有十分重要的地位。相對(duì)含量最高的棕櫚酸乙酯在后發(fā)酵階段的含量先降后升，0～14 d由33.06%降至 26.90%，14 d～28 d增加至33.38%；亞油酸乙酯0～7 d在6～7%之間波動(dòng)，后發(fā)酵第28天為12.36%；油酸乙酯僅存在于后發(fā)酵第7天和第21天樣品中，相對(duì)含量分別為4.38%和4.39%。棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯通常被稱(chēng)為白酒中三大高級(jí)脂肪酸酯，廣泛存在白酒中，能使酒體變得清甜醇香、舒適優(yōu)雅[23]。其中，棕櫚酸乙酯普遍含量最高，與本研究結(jié)果一致，其具有微弱蠟香、奶油香氣，可以增加酒體的醇厚感，降低酒的澀味，增加余味。癸酸乙酯具有椰子香型香氣，其相對(duì)含量在后發(fā)酵期內(nèi)先增加后降低，峰值出現(xiàn)在第18天樣品中，為10.29%。具有花果香氣的月桂酸乙酯也呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，峰值同樣出現(xiàn)在第18天樣品中，為6.36%。同樣具有水果香氣的辛酸乙酯的峰值也出現(xiàn)第18天的樣品中。香氣分值（odour threshold values in air，OVA）代表了復(fù)合濃度與其感官檢測(cè)閾值的比值，有研究表明，在白酒和櫻桃酒中辛酸乙酯與癸酸乙酯的香氣分值較大，呈香也較為明顯，表現(xiàn)出這兩種酯對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)度較高[24-25]。酯類(lèi)化合物能提供水果味和花香味，且隨著酯類(lèi)物質(zhì)碳原子的增加，水解速率常數(shù)降低，酯類(lèi)化合物也愈發(fā)穩(wěn)定[26]，而檢測(cè)出的酯類(lèi)物質(zhì)碳原子都在8個(gè)及以上，都相對(duì)不容易水解。另外，有研究報(bào)道，發(fā)酵酒包括米酒、黃酒中會(huì)廣泛產(chǎn)生一種致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbonate，EC）[27]，是米酒釀造過(guò)程中主要通過(guò)尿素與乙醇的自發(fā)反應(yīng)而產(chǎn)生，在本研究中未檢測(cè)到此揮發(fā)性酯類(lèi)物質(zhì)。

糙米酒后發(fā)酵樣品中醇類(lèi)物質(zhì)主要有β-苯乙醇、正癸醇、2-甲基-1-丁醇。其中，β-苯乙醇在樣品中普遍相對(duì)含量最高為13.84%～23.94%，峰值出現(xiàn)在第14天的樣品中。正癸醇的最高和最低相對(duì)含量分別為1.23%、0.37%。而2-甲基-1-丁醇在后發(fā)酵的14 d出現(xiàn)，相對(duì)含量為8.55%，此后又消失。β-苯乙醇是白酒、黃酒、葡萄酒、米酒等各類(lèi)酒類(lèi)中重要的風(fēng)味物質(zhì)，是老白干水溶性組分中香氣貢獻(xiàn)最大的香氣物質(zhì)，具有優(yōu)雅、醇香的玫瑰花香味還是其他風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[28]。β-苯乙醇主要是由酵母菌生長(zhǎng)代謝合成，可以由不同的產(chǎn)香菌株合成，其中有多種酵母具有合成β-苯乙醇能力，如釀酒酵母、畢赤酵母和異常漢遜酵母等，有研究表明，畢赤酵母可以通過(guò)艾氏途徑生成β-苯乙醇且對(duì)于β-苯乙醇的產(chǎn)生能力最為優(yōu)秀，還可以生成己酸乙酯等一系列風(fēng)味物質(zhì)[29]。正癸醇通常也存在于黃酒、白酒、葡萄酒等各種發(fā)酵酒中，略有玫瑰和橙花氣味。醇類(lèi)物質(zhì)在酒類(lèi)風(fēng)味中占重要的地位，是酒的助香劑，也是形成其他香類(lèi)物質(zhì)的前體，雖然含量少，但是為酒提供了十足的風(fēng)味。

酮類(lèi)和酚類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)在糙米酒中含量比較低，且大多數(shù)在整個(gè)后發(fā)酵階段并非一直存在。2，2，3-三甲基環(huán)丁酮在后發(fā)酵第0天樣品中出現(xiàn)為8.89%，此后未檢測(cè)出。甲基乙烯基酮含量在第7天樣品中出現(xiàn)為8.21%，此后也未檢測(cè)出。甲基酮具有成熟奶酪特有的香味，可由脂肪酸通過(guò)酶氧化脫羧（β-氧化）形成。因此，糙米中大量的脂肪酸可能是發(fā)酵糙米樣品中甲基酮產(chǎn)量增加的原因[30]。2，5-二叔丁酚在后發(fā)酵期第18天至第28天出現(xiàn)，相對(duì)含量均在1.0%左右。

酒的香氣特征是決定其質(zhì)量和價(jià)值的重要指標(biāo)，揮發(fā)性特征和感官特性影響了消費(fèi)者對(duì)酒的偏好[31]。從結(jié)果可知，隨糙米酒后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酯類(lèi)和醇類(lèi)是其主要的香氣成分。酯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量在60%～80%左右變化，醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量在15%～30%左右變化，其中棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯對(duì)糙米酒香味貢獻(xiàn)較大。同時(shí)結(jié)合感官評(píng)價(jià)認(rèn)為，在后發(fā)酵期第18天為本研究下的最佳后發(fā)酵期，其糙米酒樣品，其口感清爽、香氣濃郁并適合飲用。

3 結(jié)論

通過(guò)分批接種霉菌、酵母和乳酸菌發(fā)酵而成的糙米酒，在后發(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位的是酵母和細(xì)菌，其中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種分別為釀酒酵母菌和干酪乳桿菌。在后發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的物理化學(xué)變化以及產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)都可能與這些菌種相關(guān)，這些菌種對(duì)糙米酒的風(fēng)味和品質(zhì)起到了至關(guān)重要的作用，而畢赤酵母是酒品中主要的產(chǎn)香和產(chǎn)酯酵母，為主要提供糙米酒風(fēng)味的一類(lèi)菌種。后發(fā)酵期內(nèi)也出現(xiàn)了彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌雜菌，但隨著后發(fā)酵的進(jìn)程又出現(xiàn)消失的可能，因此，合適的后發(fā)酵期也有利于避免雜菌的滋生。糙米酒后發(fā)酵時(shí)主要風(fēng)味物質(zhì)為棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯。通過(guò)整體的風(fēng)味分析并結(jié)合感官評(píng)價(jià)可知，糙米酒后發(fā)酵期為18 d時(shí)風(fēng)味最優(yōu)，無(wú)明顯雜菌生長(zhǎng)，被認(rèn)為是最佳后發(fā)酵期。這些結(jié)果對(duì)指導(dǎo)糙米酒的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)發(fā)，增強(qiáng)糙米酒酒香和風(fēng)味提供了借鑒性數(shù)據(jù)，為開(kāi)發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良，口感豐富的糙米酒提供了理論支撐。