歐陽德文，寧亞麗，吳躍

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

糙米酒是以糙米為原料，在蒸煮的米飯或熬煮的糙米漿中添加酒曲或者接入多菌種微生物發(fā)酵而成的低酒精度產品，其營養(yǎng)和風味成分較常規(guī)米酒更為豐富，米香濃郁、酒味清爽、柔和適口，富含谷胱甘肽等多種功能性營養(yǎng)成分[1]。但由于其發(fā)酵變化更為復雜，產品品質較難控制，所以一直以來較難形成產業(yè)規(guī)模。

這些年隨著發(fā)酵等相關科學的進一步發(fā)展，國內外研究學者再次關注糙米酒的研發(fā)，其主要是對糙米酒工藝的研究，比如蘇佳佳等[2]利用模糊數學感官評價法對糙米酒的制備工藝進行優(yōu)化，并利用氣相色譜-嗅聞-質譜（gaschromatography-olfactometry-massspectrometry，GC-O-MS）對其揮發(fā)性成分進行分析，經過對比得出糙米酒風味物質比糯米酒更加豐富。Kuo等[3]將擠壓膨化處理過的糙米，加入酒曲發(fā)酵，通過與浸泡蒸煮后的糙米制備的糙米酒進行對比，發(fā)現擠壓膨化處理過的糙米制備出的糙米酒，其酒精產量提高了12.4%。Park等[4]用發(fā)芽糙米和辣椒制備糙米酒，發(fā)現添加10%～50%的辣椒較為適宜，其中20%的添加量接受度高，既增加了風味又平衡了口感；辣椒糙米酒中主要揮發(fā)類物質為乙酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇。日本早前也有利用糙米為原料，添加乳酸與葡萄酒酵母制成糙米葡萄酒，成品風味酸甜適中，果香宜人[5]。

制作發(fā)酵酒會經歷3個主要階段，包括發(fā)酵（fermentation）、后發(fā)酵（postfermentation）和陳化（aging）。對于一些葡萄酒的生產，也會將后發(fā)酵和陳化過程合二為一。在糙米酒發(fā)酵過程中，之所以能夠保持一定的酒精度，并產生適宜的風味口感，是因為大量微生物的生理作用，其中主要的微生物種類為霉菌、酵母菌、乳酸菌及醋酸菌等[6]。霉菌、酵母和細菌能產生大量的酶，用于細胞代謝和小分子生成，這些酶也有助于最終產品的風味形成[7]。糙米酒在發(fā)酵和后發(fā)酵過程中，微生物的代謝和生長對糙米酒的風味起到了決定性的作用。新釀造的糙米酒，酯類的香氣成分刺鼻，口感具有一定刺激性，經過一定時間低溫后發(fā)酵期，新酒的刺激性氣味方可消失，取而代之的是香氣濃厚、口感清爽。因此短時間低溫后發(fā)酵對糙米酒最終產品品質有至關重要的作用。酒的陳化過程可以促進醇分子之間的締合，也可以促進醇分子與水分子的締合，醇類和酸類的酯化反應也會加快[8]。酒的后發(fā)酵與陳化機理類似，主要區(qū)別在于后發(fā)酵中酒精度更低且主要風味物質成分的產生和變化主要依賴于微生物的代謝作用。典型的陳化作用是依賴于高酒精度下發(fā)生的一系列化學變化，這些變化會影響揮發(fā)性化合物和酚類化合物，例如葡萄酒在陳化過程中成分的復雜性會增加，感官特征也發(fā)生了變化[9-10]。

本文借助高通量測序和氣質聯用技術，對不同后發(fā)酵期的糙米酒菌種和揮發(fā)性物質進行對比研究，確定后發(fā)酵期的優(yōu)勢菌種和具有獨特風味的揮發(fā)性物質，以及糙米酒最佳后發(fā)酵期，為多菌種發(fā)酵糙米酒提供新的思路和科學借鑒，也為糙米酒生產提供技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機糙米：黑龍江省和糧農業(yè)有限公司；霉菌（米根霉、總狀毛霉）、酵母（釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ）、乳酸菌（戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌）：中南林業(yè)科技大學食品學院A304實驗室在酒曲中篩選所得；DNA抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；2%瓊脂糖凝膠：西班牙biowes公司；FastPfu DNA聚合酶：北京全氏金生物科技公司；DNA片段回收試劑盒：美國Axygen公司；土壤基因組DNA提取試劑盒：美國MP Biomedicals生物醫(yī)學公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700型PCR儀：美國ABI公司；Biotek ELx800酶標儀：美國Biotek公司；Illumina Miseq測序儀：美國 Illumina公司；65 μmPDMS/DVB 固相微萃取頭、手動固相微萃取裝置：美國Supelco公司；7890B-7000C氣相色譜串聯質譜-質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米酒樣品制備

稱取一定量的糙米浸泡12 h，米水比為1∶5（質量比）置于電飯煲進行熬煮4 h，趁熱分裝至藍蓋瓶中，每瓶分裝100 g米湯混合物。將總狀毛霉和米根霉按3∶2（體積比）的比例接種入瓶內，總接種量為5%，先在28℃下發(fā)酵2 d；后將釀酒酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅰ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅱ、庫德里阿茲威畢赤酵母Ⅲ4 種酵母菌按 5∶2∶2∶1（體積比）接種入瓶，總接種量為10%，后在28℃下發(fā)酵3 d；再將戊糖片球菌、干酪乳桿菌Ⅰ、干酪乳桿菌Ⅱ、短乳桿菌4種乳酸菌按1∶1∶1∶1（質量比）接種入瓶，總接種量為 10%，在 37 ℃發(fā)酵下發(fā)酵2 d。最后樣品置于4℃下分別進入后發(fā)酵期 7、14、18、21、28 d，取不同后發(fā)酵時間的樣品進行菌種和風味物質含量測定。

1.3.2 糙米酒樣品總DNA提取及聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

將后發(fā)酵樣品混勻后，吸取15 mL離心（4 000×g，10 min），收集沉淀在-80℃冷凍備用。

DNA的抽提和PCR擴增：根據土壤基因組DNA提取試劑盒說明書進行總DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽提質量；用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′）對細菌16S的V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，用引物 ITS1F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS2區(qū)域進行PCR擴增。

擴增反應體系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mol/L dNTPs 2 μL，DNA 模板 10 ng，DNA 聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 上下游引物 0.8 μL，ddH2O 補至 20 μL。

擴增反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，48℃退火 30 s，72℃延伸 4 s（30次循環(huán)），最后 72℃延伸10 min。

1.3.3 糙米酒樣品中微生物Illumina Miseq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用DNA片段回收試劑盒純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。再將純化后的擴增片段構建基因文庫。最后在Miseq PE300平臺進行上機測序，在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.4 測序數據處理

將原始測序序列優(yōu)化后，使用UPAR SE軟件（version7.1 http://drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，利用核糖體數據庫項目分類器（ribosomal database project classifier，R DP classifier）（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列比對細菌SILVA數據庫（SSU123）和真菌UNITE數據庫進行分類學注釋。

1.3.5 揮發(fā)性物質提取

將65 μm的PDMS/DVB固相微萃取頭在氣相端進樣口于250℃老化至無雜峰，取6mL酒樣置于20mL樣品瓶中，加入2.0 g氯化鈉，壓緊瓶蓋，于60℃磁力攪拌器上10 min，然后將固相微萃?。╯olid phase micro extraction process，SPME）頭插入到樣品瓶中頂空吸附40 min，隨后取出萃取頭，立即插入氣相端進樣口中于250℃解吸2 min。

1.3.6 GC-MS分析

色譜條件：HP-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣 He（純度 5 個 9），流量 1 mL/min，MMI進樣口，直接進樣，進樣口溫度250℃，柱溫：起始溫度40℃，保持2min，以5℃/min升溫至250℃，保持5min。質譜條件：接口溫度250℃，離子源溫度230℃，電離方式電子電離源，電子能量70 eV，掃描質量范圍40 amu～400 amu，掃描時間300 ms。將 GC-MS檢測的數據用MassHunter定性軟件打開，通過軟件自動積分，按質譜圖解和NIST14.L譜庫檢索（美國國家標準研究院2014譜庫）對化合物進行卷積和分析（匹配度大于80），并使用面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

1.4 數據處理

根據Barcode標簽將下機數據拆分成不同樣品，去除Barcode序列和PCR擴增引物序列。使用FLASH（version 1.2.7）軟件，通過對所有參與拼接的序列進行兩兩對比，計算其序列間的重疊關系，并對每個樣品的序列進行拼接，得到原始序列標簽數據（Raw Tags），再使用Trimmomatic（version 0.33）軟件，對原始序列標簽數據進行過濾，得到高質量的序列標簽數據，最后使用UCHME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體，得到最終有效數據。

將最終有效數據用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUS集群方法在97%的相似度水平下進行OTU聚類，利用 Mothur（version v.1.30）軟件對樣品的 α-多樣性進行評估，并基于細菌SILVA和真菌UNITE分類學數據庫對OTU進行分類學注釋，生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用Origin繪制樣品各分類學水平下的群落結構圖。

2 結果與分析

2.1 α-多樣性分析

α-多樣性反映了單個樣品內部物種的多樣性，指標有 Sobs指數、Shannon指數、Simpson指數、Ace指數、Chao指數和Coverage指數等，通過這些指標可對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估[11-12]。其中，Sobs指數用來估計群落中的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數目，OTU值是為了便于系統(tǒng)分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的統(tǒng)一標志。通過對樣本序列進行聚類，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，每個小組就是一個OTU；Shannon指數用于衡量群落的異質性；Simpson指數代表隨機取樣的兩個體系屬于不同種的概率，其值越小，代表樣品物種分布越均勻；Ace指數和Chao指數越大，群落的豐富度越高；Coverage指數用來測量通過檢測和測序得到的物種覆蓋率[13]，Coverage指數越高，代表樣品的序列在文庫中檢出的程度越高。在后發(fā)酵期的5個糙米酒樣品共獲得細菌優(yōu)化序列227 207條，共聚合了108個OTU，真菌優(yōu)化序列357 823條，共聚合了33個OTU。

所有樣品的α-多樣性指數如表1所示。

表1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品的微生物α-多樣性指數Table 1 Microbial α-diversity index of brown rice wine at different postfermentation stages

由表1可知，不同后發(fā)酵期樣品中真菌和細菌α-多樣性均存在明顯波動。其中，后發(fā)酵18 d樣品中真菌Sobs、Shannon、Ace和 Chao指數均最大，而 Simpson指數最小，說明后發(fā)酵18 d樣本的真菌群落物種豐富度、生物多樣性和物種的均勻程度都是最好。與真菌相同，細菌的最大Sobs值也出現在18 d。有區(qū)別的是，細菌最大Shannon、Ace和Chao指數出現在14 d，而最小的Simpson指數出現在21 d?？傮w來說，細菌和真菌群落的Coverage指數都大于0.9，證明樣品中的序列基本能在文庫中檢出，樣本的測序結果也更具分析價值。后發(fā)酵期的樣品中真菌的Shannon指數和Simpson指數不斷在波動，但總體是不斷向微生物多樣性更高和分布更均勻方向波動的。但樣品的細菌Shannon指數和Simpson指數是先升后降和先降后升，代表細菌的微生物多樣性和物種豐富度是先升后降的，與真菌有所區(qū)別。

2.2 糙米酒后發(fā)酵期真菌菌種演替

不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內真菌菌種在門、屬、種水平下的結構分布見圖1。

圖1 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品真菌門、屬、種水平下結構分布Fig.1 Fungal structure of phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages

由圖1中門水平下真菌相對豐度可知，真菌隸屬的兩個門分別為子囊菌門（Ascomycota）和毛菌亞門（Mucromycota），發(fā)酵最初接種的霉菌米根霉和總狀毛霉均隸屬于毛菌亞門，發(fā)酵接種的酵母菌屬于子囊菌門，其中子囊菌門在所有樣品的平均豐度值最高，為99%左右，而毛菌亞門豐度值在0.6%～1.07%之間波動，說明子囊菌門在糙米酒后發(fā)酵期的真菌菌種結構占有重要地位，為絕對優(yōu)勢菌種。在屬水平下，圖中給出了豐度前3的菌種，其他豐度占比較小的均合并在其它類。如圖1所示，糙米酒中主要真菌菌種有酵母屬（Saccharomyces）、畢赤氏酵母屬（Pichia）和毛霉屬（Mucor），其中酵母屬占絕對優(yōu)勢地位為93.90%左右，在28 d后發(fā)酵期畢赤氏酵母屬相對豐度從3%提升到了11%，提高近4倍；毛霉屬在糙米酒中后發(fā)酵初期含量為8.32%，而隨著糙米酒后發(fā)酵的進行，毛霉屬14 d時豐度低至0.8%左右，且后期一直保持不變?？傮w而言，酵母屬在整個后發(fā)酵階段都占有絕對主導地位，畢赤氏酵母屬在后發(fā)酵第28天相對豐度較前期呈波動性增加，毛霉屬處于低水平。

在種水平下，主要的真菌菌種為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、未分類畢赤氏酵母屬菌種（Unclassified pichia）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。其中，釀酒酵母菌為絕對優(yōu)勢菌種，平均豐度達到了93.90%。而隨著后發(fā)酵的延長，畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度呈現增加趨勢，在后發(fā)酵第28天時，未分類畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度增長了4倍左右，達到了11.47%。而卷枝毛霉在后發(fā)酵期的14 d豐度顯著降低，后一直保持不變，可能是由于釀酒酵母的生長抑制了卷枝毛霉的活性，后發(fā)酵期的風味變化應該主要取決于真菌中的酵母。釀酒酵母除了會將原料中的糖轉化為酒精外，還能將原料中的氨基酸等前體物質轉換為酯、酸、高級醇等風味物質[14]。但有研究表明，釀酒酵母會抑制產香酵母的生長，產香酵母也會抑制釀酒酵母的發(fā)酵能力，通常認為是釀酒酵母的代謝產物造成了產香酵母生長的不利條件，包括產酸與乙醇，同時高密度的細胞也對產香酵母的增殖造成了消極影響，但是兩者混合發(fā)酵時總體的發(fā)酵水平下降不多，但乙酸乙酯等風味物質卻大幅增加[15-16]。但根據研究結果，二者在分批接種發(fā)酵時，前期釀酒酵母占優(yōu)勢菌種地位，畢赤酵母屬在前5 d未發(fā)現，在6、7 d增加，增加至5.21%，到了后發(fā)酵期，釀酒酵母仍是主要優(yōu)勢菌種，畢赤氏酵母屬菌種的相對豐度也略有增加。釀酒酵母在酒類產品的應用十分廣泛，不同菌株的組合還能使釀酒酵母的代謝發(fā)生變化，如釀酒酵母與植物乳桿菌和Oenococcus oeni菌株組合還對蘋果酸消耗和代謝物生產有影響[17]。

2.3 糙米酒后發(fā)酵期細菌菌種演替

不同后發(fā)酵期的糙米酒樣品內細菌菌種在門、屬、種水平下的結構分布見圖2。

圖2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品細菌門、屬、種水平下結構分布Fig.2 Bacterial structure of different phylum,genus,and species levels of brown rice wine samples at different postfermentation stages

由圖2中門水平下細菌相對豐度可知，主要細菌優(yōu)勢菌門分別是厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），發(fā)酵最初接種的細菌為1株戊糖片球菌、2株干酪乳桿菌和1株短乳桿菌均隸屬于厚壁菌門，且厚壁菌門是米酒后發(fā)酵期的絕對優(yōu)勢菌種，平均相對豐度達到了97.90%，而變形菌門是污染的外來菌種相對豐度由最初的0.029%升至第14天的6.50%，第18天急劇下降至0.6%，到后發(fā)酵21 d幾乎不能被檢出。在屬水平下，糙米酒中后發(fā)酵期主要細菌菌屬為發(fā)酵時添加的乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）以及外來污染的寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中整個后發(fā)酵期的乳桿菌屬是絕對優(yōu)勢細菌種，而且在糙米酒發(fā)酵過程中，乳桿菌屬也是優(yōu)勢菌種，有研究表明其與米酒的酸度高度相關，是發(fā)酵中產生酸的關鍵細菌[18]。而發(fā)酵添加的片球菌屬從發(fā)酵結束一直到整個后發(fā)酵期的豐度極低，最高值是21 d的1.40%。后發(fā)酵第14天，寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬的相對豐度達到最高，分別平均為2.14%和1.48%，但在后期驟然遞減至幾乎沒有，可能是由于寡養(yǎng)單胞菌屬和假單胞菌屬都屬于專性需氧菌，后發(fā)酵過程中，體系氧氣不斷被消耗，二者豐度降低。也有研究表明，假單胞菌減少的原因可能是它不能發(fā)酵葡萄糖，所以后發(fā)酵的后期糖源減少時假單胞菌屬相對豐度也隨之減少[19]。

在種水平下，主要細菌菌種為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、彎曲假單胞菌（Pseudomonas geniculata）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。其中，發(fā)酵時添加的干酪乳桿菌在后熟期相對豐度一直處于80%以上，為絕對優(yōu)勢菌種。有研究表明，在利用固定化釀酒酵母生產葡萄酒時，通過添加固定化的干酪乳桿菌使得葡萄酒中的蘋果酸降解，乙酸乙酯濃度顯著增加[20]。干酪乳桿菌在食品生產中的應用十分廣泛，可發(fā)酵產生有機酸、細菌素等多種抑菌物質[21]，還可能對改善腸道健康有所幫助。

發(fā)酵時添加的短乳桿菌在后發(fā)酵期豐度存在明顯波動，由0 d的5.77%增長至18 d的18.20%，但在21 d時顯著降回了8.88%，且戊糖片球菌在發(fā)酵結束后和整個后發(fā)酵期豐度極低，最高值出現在21 d為1.4%，說明可能是其它菌種創(chuàng)造出不利于戊糖片球菌生長的環(huán)境，或是其它乳酸菌產生的細菌素對其生長產生了抑制作用[22]。

作為雜菌的彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌在發(fā)酵結束后，其豐度極低幾乎檢測不到，但隨著后發(fā)酵期的延長，在第14天時二者豐度明顯增加達到最大，分別為2.94%和2.26%。但到后發(fā)酵第18天，二者豐度驟減，與屬水平下豐度變化相似，可能是由于后發(fā)酵過程中氧氣消耗或是由于不能利用糖源，使得這兩類專性好氧菌數量減少。后發(fā)酵期第7天時能檢測到外來細菌，此后幾乎檢測不到，細菌多樣性的結果說明，污染的外來細菌在適當的后發(fā)酵期內自然被抑制，說明選擇合適的后發(fā)酵期可以避免雜菌的滋生，有利于產品安全。

2.4 糙米酒后發(fā)酵期揮發(fā)性風味物質變化

糙米酒后發(fā)酵期揮發(fā)性風味物質變化見表2。

表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風味物質Table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %

續(xù)表2 不同后發(fā)酵期糙米酒樣品揮發(fā)性風味物質Continue table 2 The volatile flavor substances of brown rice wine samples at different postfermentation stages %

如表2所示，利用氣相色譜-質譜技術分析糙米酒后發(fā)酵階段樣品共檢測出45種揮發(fā)性物質，其中相含量最高、種類最多的化合物是酯類，其次是醇類，最后分別是酮類和酚類。

酯類物質主要有11種，包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、松香酸乙酯、硬脂酸乙酯、琥珀酸二乙酯、異氰酸甲酯，這些化合物大部分屬于乙酯類，說明乙酯類化合物在揮發(fā)性物質組成上占有十分重要的地位。相對含量最高的棕櫚酸乙酯在后發(fā)酵階段的含量先降后升，0～14 d由33.06%降至 26.90%，14 d～28 d增加至33.38%；亞油酸乙酯0～7 d在6～7%之間波動，后發(fā)酵第28天為12.36%；油酸乙酯僅存在于后發(fā)酵第7天和第21天樣品中，相對含量分別為4.38%和4.39%。棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯通常被稱為白酒中三大高級脂肪酸酯，廣泛存在白酒中，能使酒體變得清甜醇香、舒適優(yōu)雅[23]。其中，棕櫚酸乙酯普遍含量最高，與本研究結果一致，其具有微弱蠟香、奶油香氣，可以增加酒體的醇厚感，降低酒的澀味，增加余味。癸酸乙酯具有椰子香型香氣，其相對含量在后發(fā)酵期內先增加后降低，峰值出現在第18天樣品中，為10.29%。具有花果香氣的月桂酸乙酯也呈現波動性變化，峰值同樣出現在第18天樣品中，為6.36%。同樣具有水果香氣的辛酸乙酯的峰值也出現第18天的樣品中。香氣分值（odour threshold values in air，OVA）代表了復合濃度與其感官檢測閾值的比值，有研究表明，在白酒和櫻桃酒中辛酸乙酯與癸酸乙酯的香氣分值較大，呈香也較為明顯，表現出這兩種酯對整體香氣的貢獻度較高[24-25]。酯類化合物能提供水果味和花香味，且隨著酯類物質碳原子的增加，水解速率常數降低，酯類化合物也愈發(fā)穩(wěn)定[26]，而檢測出的酯類物質碳原子都在8個及以上，都相對不容易水解。另外，有研究報道，發(fā)酵酒包括米酒、黃酒中會廣泛產生一種致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbonate，EC）[27]，是米酒釀造過程中主要通過尿素與乙醇的自發(fā)反應而產生，在本研究中未檢測到此揮發(fā)性酯類物質。

糙米酒后發(fā)酵樣品中醇類物質主要有β-苯乙醇、正癸醇、2-甲基-1-丁醇。其中，β-苯乙醇在樣品中普遍相對含量最高為13.84%～23.94%，峰值出現在第14天的樣品中。正癸醇的最高和最低相對含量分別為1.23%、0.37%。而2-甲基-1-丁醇在后發(fā)酵的14 d出現，相對含量為8.55%，此后又消失。β-苯乙醇是白酒、黃酒、葡萄酒、米酒等各類酒類中重要的風味物質，是老白干水溶性組分中香氣貢獻最大的香氣物質，具有優(yōu)雅、醇香的玫瑰花香味還是其他風味物質的前體物質[28]。β-苯乙醇主要是由酵母菌生長代謝合成，可以由不同的產香菌株合成，其中有多種酵母具有合成β-苯乙醇能力，如釀酒酵母、畢赤酵母和異常漢遜酵母等，有研究表明，畢赤酵母可以通過艾氏途徑生成β-苯乙醇且對于β-苯乙醇的產生能力最為優(yōu)秀，還可以生成己酸乙酯等一系列風味物質[29]。正癸醇通常也存在于黃酒、白酒、葡萄酒等各種發(fā)酵酒中，略有玫瑰和橙花氣味。醇類物質在酒類風味中占重要的地位，是酒的助香劑，也是形成其他香類物質的前體，雖然含量少，但是為酒提供了十足的風味。

酮類和酚類揮發(fā)性物質在糙米酒中含量比較低，且大多數在整個后發(fā)酵階段并非一直存在。2，2，3-三甲基環(huán)丁酮在后發(fā)酵第0天樣品中出現為8.89%，此后未檢測出。甲基乙烯基酮含量在第7天樣品中出現為8.21%，此后也未檢測出。甲基酮具有成熟奶酪特有的香味，可由脂肪酸通過酶氧化脫羧（β-氧化）形成。因此，糙米中大量的脂肪酸可能是發(fā)酵糙米樣品中甲基酮產量增加的原因[30]。2，5-二叔丁酚在后發(fā)酵期第18天至第28天出現，相對含量均在1.0%左右。

酒的香氣特征是決定其質量和價值的重要指標，揮發(fā)性特征和感官特性影響了消費者對酒的偏好[31]。從結果可知，隨糙米酒后發(fā)酵時間的延長，酯類和醇類是其主要的香氣成分。酯類物質相對含量在60%～80%左右變化，醇類物質相對含量在15%～30%左右變化，其中棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯對糙米酒香味貢獻較大。同時結合感官評價認為，在后發(fā)酵期第18天為本研究下的最佳后發(fā)酵期，其糙米酒樣品，其口感清爽、香氣濃郁并適合飲用。

3 結論

通過分批接種霉菌、酵母和乳酸菌發(fā)酵而成的糙米酒，在后發(fā)酵過程中占主導地位的是酵母和細菌，其中絕對優(yōu)勢菌種分別為釀酒酵母菌和干酪乳桿菌。在后發(fā)酵過程中發(fā)生的物理化學變化以及產生的風味物質都可能與這些菌種相關，這些菌種對糙米酒的風味和品質起到了至關重要的作用，而畢赤酵母是酒品中主要的產香和產酯酵母，為主要提供糙米酒風味的一類菌種。后發(fā)酵期內也出現了彎曲假單胞菌和銅綠假單胞菌雜菌，但隨著后發(fā)酵的進程又出現消失的可能，因此，合適的后發(fā)酵期也有利于避免雜菌的滋生。糙米酒后發(fā)酵時主要風味物質為棕櫚酸乙酯、β-苯乙醇、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯。通過整體的風味分析并結合感官評價可知，糙米酒后發(fā)酵期為18 d時風味最優(yōu)，無明顯雜菌生長，被認為是最佳后發(fā)酵期。這些結果對指導糙米酒的工業(yè)化生產開發(fā)，增強糙米酒酒香和風味提供了借鑒性數據，為開發(fā)出品質優(yōu)良，口感豐富的糙米酒提供了理論支撐。