范雁，楊淼，姜君鵬，馮迪娜，薛松

（1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024）

南極磷蝦是南極海洋中主要的磷蝦種類，近年來(lái)，磷蝦的營(yíng)養(yǎng)保健功能已被廣泛報(bào)道[1-3]，其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)成分使得人們對(duì)磷蝦產(chǎn)品研發(fā)的興趣日益增加。極性脂和甘油三酯(tiglyceride，TAG)是南極磷蝦的主要脂質(zhì)組分，分別占其總脂含量的56%～81%和12%～38%[4]。南極磷蝦油是從整個(gè)南極磷蝦或磷蝦粉獲得的脂質(zhì)提取物，磷蝦油中磷脂（phospholipid，PL）占總脂含量的40%以上[5]，這與植物食用油以TAG（＞95%）為主要脂質(zhì)組分不同。南極磷蝦油富含ω-3型多不飽和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA），特別是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。研究表明，EPA和DHA作為重要的功能性脂肪酸能改善人類的大腦功能[6]、降低心血管風(fēng)險(xiǎn)[7]和減少慢性炎癥[8]等。磷蝦中的EPA和DHA主要以磷脂形式存在[9-10]，而魚(yú)類中的ω-3 PUFA主要以TAG形式存在。研究表明，相比于TAG型EPA和DHA，PL型EPA和DHA能夠更好地滲入組織中，具有更強(qiáng)的心臟保護(hù)作用[11]和生物活性[12]。隨著消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)磷蝦油的需求量不斷增加，市場(chǎng)上出現(xiàn)的許多品牌的南極磷蝦油，品質(zhì)差異較大[13]。為了磷蝦油產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，要健全其產(chǎn)品的過(guò)程控制及質(zhì)量的評(píng)價(jià)體系。目前EPA和DHA含量為磷蝦油品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[14]，通過(guò)在磷蝦油產(chǎn)品中添加魚(yú)油可提高EPA和DHA含量。因此建立更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)磷蝦油產(chǎn)品方法對(duì)于磷蝦油產(chǎn)品市場(chǎng)健康發(fā)展具有重要意義[15-16]。

基于內(nèi)標(biāo)十七烷酸甲酯（methyl heptadecanoate，C17:0-ME）的EPA定量分析方法，通過(guò)薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）分離，采用氣相色譜法定量分析南極磷蝦油卵磷脂（lecithin，PC）型EPA的含量，提出南極磷蝦油PC型EPA占總EPA比例的評(píng)價(jià)指標(biāo)，這一指標(biāo)可以有效定量EPA的單一存在形式，甄別出含有外源添加EPA的南極磷蝦油，本文利用該指標(biāo)分析了6種不同來(lái)源南極磷蝦油的品質(zhì)，為南極磷蝦產(chǎn)品的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

正己烷（色譜純）：德國(guó)Merck公司；氯仿、甲醇、三乙胺、丙酮（分析純）：天津科密歐有限公司；二十碳五烯酸甲酯（methyl eicosapentaenoate，EPA-ME）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.5%）、C17:0-ME標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、PC標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：美國(guó)SIGMA公司。

1.2 南極磷蝦油樣品

南極磷蝦油樣品及廠家見(jiàn)表1。

表1 南極磷蝦油樣品及其廠家Table 1 Antarctic krill oil samples and manufacturers

1.3 儀器與設(shè)備

7890B型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent公司；BS210S分析天平：德國(guó)Sartorius公司；Silica gel 60 F254硅膠板（0.20 mm，20 cm×20 cm）：德國(guó)Merck公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

EPA-ME標(biāo)準(zhǔn)溶液：用正己烷分別配制成濃度為 0.20、0.23、0.29、0.33、0.39 mg/mL；C17:0-ME 標(biāo)準(zhǔn)溶液：用正己烷分別配制成濃度為 0.04、0.19、0.38、0.57、0.76 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2 南極磷蝦油樣品轉(zhuǎn)酯化

稱量南極磷蝦油樣品至10 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 2%的H2SO4-甲醇，70℃油浴反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫（25℃），向燒瓶中加入2 mL正己烷和0.75 mL蒸餾水，混合30 s[17]。取上層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜分析[18]。

1.4.3 氣相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：DB-23色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），色譜柱升溫程序：130℃保持1 min；130℃～170℃，10℃/min；170℃～215℃，2.8℃/min保持 1 min。進(jìn)樣口溫度：270℃，氫火焰離子化檢測(cè)器溫度：270℃，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比 10∶1，進(jìn)樣量：1 μL，載氣：高純氮?dú)猓?9.99%）。

1.4.4 校正因子的計(jì)算

分別讀取EPA-ME和C17:0-ME（內(nèi)標(biāo)）峰面積，按下式計(jì)算校正因子。

式中：f為校正因子；A內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)C17:0-ME峰面積；A標(biāo)準(zhǔn)品為 EPA-ME 峰面積；M內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo) C17:0-ME質(zhì)量，mg；M標(biāo)準(zhǔn)品為 EPA-ME 的質(zhì)量，mg。

1.4.5 南極磷蝦油中EPA含量的測(cè)定

采用校正的內(nèi)標(biāo)法對(duì)EPA進(jìn)行定量，EPA的含量（xi）計(jì)算公式如下。

式中：Ai為EPA的峰面積；A內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)C17:0-ME的峰面積；Mi為所稱取南極磷蝦油的準(zhǔn)確質(zhì)量，mg；M內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo) C17:0-ME 質(zhì)量，mg。

1.4.6 PC型EPA含量的定量分析

稱取等質(zhì)量的南極磷蝦油樣品，用氯仿溶解點(diǎn)于硅膠板上，展開(kāi)劑采用氯仿∶甲醇∶水∶三乙胺（50∶40∶8∶50，體積比）[19]。待溶劑完全揮發(fā)后，利用濃度0.05%（溶劑為20%水和80%丙酮）櫻草黃噴霧顯色，紫外燈365 nm下觀察。將PC條帶刮下，按照1.4.2和1.4.3進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化和氣相色譜分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（n=3），利用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)不同南極磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)的差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)差異顯著時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Turkey多重比較分析，以P＜0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于C17:0-ME內(nèi)標(biāo)法的EPA定量分析

C17:0-ME、EPA-ME標(biāo)準(zhǔn)品及不同來(lái)源南極磷蝦油樣品的氣相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 C17:0-ME、EPA-ME標(biāo)準(zhǔn)品及不同來(lái)源南極磷蝦油樣品的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograph of EPA-ME,C17:0-ME standards and Antarctic krill oil samples from different sources

由圖1可知，EPA-ME和C17:0-ME標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為14.9、7.5min，兩種脂肪酸甲酯完全分離。此外，南極磷蝦油樣品4的EPA-ME的保留時(shí)間為14.9min，樣品5～9的EPA-ME的保留時(shí)間為15.8min。從氣相色譜分析圖中可以定性比較不同來(lái)源南極磷蝦油樣品PC型EPA的含量，圖1顯示，樣品6和樣品7的PC型EPA的含量較高，樣品5和9次之，樣品4和8較低。

不同濃度EPA-ME對(duì)內(nèi)標(biāo)C17:0-ME的相對(duì)質(zhì)量校正因子見(jiàn)表2。

表2 EPA-ME對(duì)內(nèi)標(biāo)C17:0-ME的相對(duì)質(zhì)量校正因子Table 2 The relative mass correction factor of EPA-ME in relative to the internal standard C17:0-ME

由表2可知，C17:0-ME濃度的線性范圍為0.04 mg/mL～0.76 mg/mL，在該范圍內(nèi)得到EPA-ME對(duì)C17:0-ME的相對(duì)質(zhì)量校正因子為1.52。

2.2 南極磷蝦油PC型EPA的定量分析及PC型EPA含量占總EPA含量比例的確定

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品和樣品1～3的磷脂分離見(jiàn)圖2。

圖2 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品和南極磷蝦油磷脂的分離Fig.2 Separation of phospholipid standard and Antarctic krill oil phospholipid

由圖2可知，南極磷蝦油的PL主要包括PC、溶血磷脂酰膽堿（lysolecithin，LPC）和PE，而PC和LPC是南極磷蝦油的主要組分，本研究測(cè)定的PC組分是分離的PC和LPC含量之和。

基于C17:0-ME對(duì)EPA-ME的相對(duì)質(zhì)量校正因子計(jì)算得到南極磷蝦油樣品1～3的PC型EPA的含量，具體見(jiàn)表3。

表3 南極磷蝦油樣品1～3的品質(zhì)分析Table 3 Quality evaluation of Antarctic krill oils samples 1-3

從TLC中獲得的PC組分，由于量非常少，大約為0.5 mg～1 mg，用稱重法難以進(jìn)行準(zhǔn)確定量。因此，將TLC分離得到的樣品PC經(jīng)轉(zhuǎn)酯化進(jìn)行了脂肪酸甲酯的定量分析。比較樣品1和2的總EPA含量以及PC型EPA的含量，總EPA含量均為南極磷蝦油質(zhì)量的10%以上，樣品1中的總EPA含量比樣品2高27%。從總EPA含量來(lái)分析兩個(gè)樣品的品質(zhì)，樣品1優(yōu)于樣品2。通過(guò)對(duì)其PC型EPA的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，樣品1的PC型EPA含量約為樣品2的2倍，結(jié)合總EPA的含量，計(jì)算得到兩個(gè)樣品PC型EPA占總EPA含量的比例，均大于50%，且樣品1比樣品2高27%。從這一參數(shù)分析兩個(gè)樣品的品質(zhì)，得到的結(jié)論與通過(guò)總EPA含量分析得到的結(jié)果一致，說(shuō)明PC型EPA含量占總EPA含量比例這一參數(shù)可以作為分析不同來(lái)源南極磷蝦油品質(zhì)的指標(biāo)，且能夠準(zhǔn)確定量南極磷蝦油樣品中的PC型EPA含量。此外，樣品3所含PC型EPA含量占總EPA含量比例高達(dá)85%左右。雖然樣品1和2的PC型EPA含量占總EPA含量的比例達(dá)到了50%以上，但其品質(zhì)還能夠通過(guò)工藝優(yōu)化進(jìn)一步提高。

按照1.4.5和1.4.6方法計(jì)算不同來(lái)源南極磷蝦油（樣品4～9）PC型EPA含量占總EPA含量的比例，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同來(lái)源南極磷蝦油（樣品4～9）品質(zhì)的比較Table 4 Comparison of the quality of Antarctic krill oil samples（4-9）from different sources

從測(cè)定結(jié)果分析，樣品5和6的總EPA含量無(wú)顯著差異，但樣品6中PC型EPA含量占總EPA含量的比例顯著高于樣品5，且樣品6中PC型EPA含量是非PC型EPA含量的2倍左右，綜合總EPA含量的數(shù)據(jù)和PC型EPA/總EPA含量數(shù)據(jù)，說(shuō)明了樣品6中EPA的存在形式主要是PC型。比較樣品5和8，樣品5的總EPA含量約為樣品8的2倍，但兩個(gè)樣品PC型EPA含量占總EPA含量的比例無(wú)顯著差異，同時(shí)樣品5和樣品8的PC型EPA含量與非PC型EPA含量的比值相當(dāng)，說(shuō)明兩個(gè)樣品的EPA存在形式是一致的。

樣品9的總EPA含量達(dá)到17.9%，均高于其它5種南極磷蝦油，但其PC型EPA含量占總EPA含量的比例只有29.7%，均低于其它5種南極磷蝦油，表明該樣品的EPA主要以非磷脂型EPA形式存在，如TAG型或游離型EPA。因此南極磷蝦油中總EPA含量不能反映EPA的存在形式，而PC型EPA含量占總EPA含量的比例能夠?qū)δ蠘O磷蝦油EPA的存在形式進(jìn)行準(zhǔn)確的表征，區(qū)別出含有外加非磷脂型EPA的蝦油。PC型EPA含量占總EPA含量的比例作為過(guò)程控制參數(shù)，也可以表征磷脂的水解情況。

根據(jù)這一參數(shù)分析本研究中這6種南極磷蝦油樣品的品質(zhì)，較優(yōu)的為樣品6和樣品7，PC型EPA含量占總EPA含量的比例均在60%以上；其次為樣品4、5、8。這5種樣品PC型EPA含量占總EPA含量的比例在48%～70%之間；而樣品9的該參數(shù)顯著低于其它5種樣品，以此為標(biāo)準(zhǔn)可以鑒定不同南極磷蝦油產(chǎn)品的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究建立了基于C17:0-ME內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確測(cè)定EPA的定量方法，測(cè)定得到的EPA-ME相比于C17:0-ME的相對(duì)質(zhì)量校正因子為1.52。結(jié)合TLC分離定量分析了南極磷蝦油PC型EPA的含量，提出了PC型EPA含量占總EPA含量的比例這一南極磷蝦油品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)這一參數(shù)分析了6種不同來(lái)源南極磷蝦油的品質(zhì)，并篩選出優(yōu)質(zhì)南極磷蝦油（樣品6和樣品7），其PC型EPA含量占總EPA含量的比例在60%以上，最高可達(dá)70%，這些結(jié)果為南極磷蝦油產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)體系的建立提供科學(xué)依據(jù)。