宋曉梅，劉雨思，趙書利，李 晨，趙硯馳，李 化，舒莉萍△

1.貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州貴陽 550004;2.貴州省貴陽市婦幼保健院檢驗(yàn)科，貴州貴陽 550004；3.延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000;4.長江航運(yùn)總醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430014;5.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞的異常增生性腫瘤，雖然病程發(fā)展較慢，但發(fā)病率較高，約占新發(fā)白血病病例的10%[1]。CML的傳統(tǒng)療法治療后不良反應(yīng)多、易復(fù)發(fā)，分子靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑的出現(xiàn)雖然使CML的治療效果與以往比較取得了重要進(jìn)展[2]，但是酪氨酸激酶抑制劑不能清除靜止期的白血病干細(xì)胞，因此，停藥后復(fù)發(fā)是目前酪氨酸激酶抑制劑治療CML難以克服的一個瓶頸[3]，這些困難仍困擾著眾多臨床醫(yī)生及患者。異基因造血干細(xì)胞移植雖有望治愈CML，但是由于配型相合的干細(xì)胞來源有限、并發(fā)癥多及費(fèi)用高昂使這種治療方案難以普及，為此有必要探索治療CML的新方法，比如免疫療法。K562細(xì)胞是來源于CML急性病變患者的異常細(xì)胞，具有Ph染色體， K562細(xì)胞可以作為構(gòu)建CML的細(xì)胞模型。溶瘤病毒是指能夠感染腫瘤細(xì)胞并致其死亡而對正常組織沒有影響的非致病性病毒顆粒，它可以通過在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制來增加病毒載量殺死腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的目標(biāo)，是惡性腫瘤治療領(lǐng)域中的新治療方式[4-5]。呼腸孤病毒(Reovirus)作為一種天然存在的溶瘤病毒，不僅可以通過選擇性殺死腫瘤細(xì)胞直接發(fā)揮溶瘤作用，還能誘導(dǎo)機(jī)體的免疫活性介導(dǎo)優(yōu)異的抗腫瘤作用[6]。利用天然的腫瘤歸巢細(xì)胞(如干細(xì)胞)作為細(xì)胞載體將Reovirus遞送到腫瘤，能幫助病毒逃避機(jī)體的免疫清除，使溶瘤病毒能夠到達(dá)腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制來殺傷腫瘤細(xì)胞成為可能[7]。人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)有較強(qiáng)的自我更新能力及多向分化潛能，來源較為廣泛且不損傷供者的身體，易于轉(zhuǎn)染外源基因，因此，已被眾多研究證實(shí)是細(xì)胞替代治療的理想來源。“歸巢”最早是指淋巴細(xì)胞在體內(nèi)依靠歸巢受體傾向于由定居地經(jīng)淋巴循環(huán)及血液循環(huán)不斷往返于外周免疫器官、外周淋巴組織及全身器官組織，最終再回到外周免疫器官及外周淋巴組織的過程，后來這一概念逐漸引申至循環(huán)系統(tǒng)中特定的細(xì)胞類群，如干細(xì)胞、免疫細(xì)胞在多種因素的作用下能定向趨向性遷移至機(jī)體組織或器官微環(huán)境，維持或重塑其細(xì)胞命運(yùn)的生命過程，類似于人體局部炎性反應(yīng)后大量白細(xì)胞遷移至炎性反應(yīng)周圍。2002年，SAITO等[8]證明了MSCs的歸巢能力，有研究表明，利用MSCs的腫瘤歸巢能力可將抗癌基因產(chǎn)物直接遞送至腫瘤病灶[9]。單獨(dú)的溶瘤病毒Reovirus3進(jìn)入機(jī)體有可能被體內(nèi)針對Reovirus3產(chǎn)生的抗體中和，所以本研究選用具有腫瘤歸巢能力的MSCs作為運(yùn)載Reovirus3的載體可使之躲過體內(nèi)抗體的攻擊，使Reovirus3能夠到達(dá)腫瘤病灶并進(jìn)行復(fù)制來殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究探討細(xì)胞培養(yǎng)體系中相關(guān)細(xì)胞因子對MSCs運(yùn)載Reovirus3殺傷K562細(xì)胞的影響,為利用細(xì)胞因子治療或者輔助MSCs運(yùn)載Reovirus3治療CML提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 K562細(xì)胞株(美國ATCC公司)；Reovirus3病毒株(貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞中心)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(FBS ， BI公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Solarbio公司)；ELISA細(xì)胞因子檢測試劑盒(安徽巧伊生物科技有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2方法與步驟

1.2.1細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 參照劉雨思[10]及《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》，通過體外實(shí)驗(yàn)從臍帶中分離培養(yǎng)MSCs，取第3代處于對數(shù)生長期的MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。K562細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃,5%CO2條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組 對照組：K562細(xì)胞；MSCs組：K562細(xì)胞+MSCs； Reovirus3組(陽性對照組)：K562細(xì)胞+Reovirus3；實(shí)驗(yàn)組：K562細(xì)胞+Reovirus3+MSCs。

1.2.3檢測方法 分別收集共培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心5 min，采用ELISA雙抗體夾心法，按照試劑說明書檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-17水平。培養(yǎng)24、48、72 h后培養(yǎng)體系中的K562細(xì)胞由本課題組劉雨思[10]進(jìn)行K562細(xì)胞增殖抑制能力檢測。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)24 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較 培養(yǎng)24 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液均未檢測出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。見表1。

表1 培養(yǎng)24 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較

2.2培養(yǎng)48 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較 培養(yǎng)48 h 時MSCs組、Reovirus3組和實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4水平雖然均高于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)48 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液均未檢測出IL-5和IL-17。見表2。

表2 培養(yǎng)48 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較

2.3培養(yǎng)72 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較 培養(yǎng)72 h時 MSCs組和實(shí)驗(yàn)組TGF-β、IL-6水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Reovirus3組比對照組TGF-β、IL-6水平雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)72 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液均未檢測出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。見表3。

表3 72 h時4組細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平比較

3 討 論

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成并分泌的具有多種生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和發(fā)育、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)及造血中發(fā)揮重要作用。MSCs可分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-6、IL-7、IL-8、白血病抑制因子、IFN-γ及TNF-α，MSCs具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能，它的免疫調(diào)節(jié)功能是通過細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子，還有細(xì)胞與細(xì)胞之間受體與配體的相互作用或者兩種機(jī)制的組合來實(shí)現(xiàn)。因此，可以通過檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子來評價抑瘤體系對白血病細(xì)胞溶瘤作用的效果和可行程度。有研究顯示，MSCs分泌的細(xì)胞因子可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，改變K562細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，這些細(xì)胞因子可通過BAX和Caspace-3級聯(lián)途徑抑制K562細(xì)胞增殖[11]。此外，MSCs分泌的細(xì)胞因子IFN可以激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)途徑，Reovirus3感染K562細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄過程中的小基因片段編碼的σ3蛋白也可以引起PKR的活化，經(jīng)IFN及σ3蛋白激活的PKR可引起細(xì)胞凋亡來抑制K562細(xì)胞的增殖[12]。

本課題組劉雨思[10]采用流式細(xì)胞儀檢測了MSCs與K562細(xì)胞表面Reovirus3易感受體重組人連接黏附分子-A(JAM-A)的表達(dá)量分別為11%和99%，JAM-A在K562細(xì)胞表面高表達(dá)。K562細(xì)胞增殖抑制能力檢測結(jié)果顯示，對照組和Reovirus3組(陽性對照組)K562細(xì)胞隨著時間延長細(xì)胞存活率始終最高和最低， MSCs組在24 h時發(fā)現(xiàn)MSCs有一定促進(jìn)腫瘤生長的作用，但隨著共培養(yǎng)時間的延長這種促瘤作用轉(zhuǎn)為抑瘤作用。實(shí)驗(yàn)組與MSCs組相似，在24 h時發(fā)現(xiàn)MSCs有一定促進(jìn)腫瘤生長的作用，隨著共培養(yǎng)時間延長至72 h時，實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞存活率與Reovirus3組(陽性對照組)接近。在Reovirus3存在的Reovirus3組和實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞存活率明顯低于對照組，可能是因?yàn)镽eovirus3感染K562細(xì)胞后激活了PKR途徑，引起細(xì)胞凋亡。而MSCs組和實(shí)驗(yàn)組在24 h時發(fā)現(xiàn)MSCs有一定促進(jìn)腫瘤生長的作用，但隨著共培養(yǎng)時間的延長這種促瘤作用轉(zhuǎn)為抑瘤作用，可能是因?yàn)殡S著共培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的細(xì)胞因子對抗腫瘤的作用得以發(fā)揮，由促瘤作用轉(zhuǎn)為抑瘤作用。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子，48 h時在MSCs存在的情況下，細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IFN-γ水平比并沒有MSCs存在的Reovirus3組和對照組高，培養(yǎng)體系中的IFN-γ可能激活了PKR途徑引起細(xì)胞凋亡，TNF-α可能是通過啟動Caspase信號通路使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。4組IL-2、IL-4水平較為接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)體系中IL-2、IL-4主要由K562細(xì)胞自分泌產(chǎn)生參與免疫應(yīng)答。24、72 h時細(xì)胞培養(yǎng)上清液均未檢測出TNF-α、IFN-γ、IL-2及IL-4，可能是因?yàn)檫@2個時間點(diǎn)的這4種細(xì)胞因子水平較低，采用ELISA雙抗體夾心法沒有檢測出來。IL-4能以自分泌的方式促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，參與變態(tài)反應(yīng)，在腫瘤免疫中起抑制腫瘤免疫應(yīng)答的作用。IL-2可由CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，另外轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞、白血病細(xì)胞亦可產(chǎn)生,是對免疫系統(tǒng)具有重要作用的細(xì)胞因子之一，可以使細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)增殖，并使它們的殺傷活性增強(qiáng)，還可促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌抗體和IFN，具有抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，改進(jìn)的IL-2制劑可單獨(dú)使用，與其他的抗癌免疫療法結(jié)合有望治療轉(zhuǎn)移性癌癥[13]。培養(yǎng)24、48、72 h時MSCs組和實(shí)驗(yàn)組TGF-β、IL-6水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Reovirus3組TGF-β、IL-6水平雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組TGF-β水平隨著時間的推移不斷降低，可能是因?yàn)門GF-β對腫瘤具有雙重作用，隨著時間的推移被逐漸消耗及不斷降解而減少，還可能與K562細(xì)胞死亡率逐漸增加及培養(yǎng)體系中的營養(yǎng)逐漸消耗有關(guān)。48 h時IL-6水平最高，之后降低可能與IL-6隨著時間的推移不斷降解，以及培養(yǎng)體系中營養(yǎng)逐漸消耗及K562細(xì)胞死亡率逐漸增加有關(guān)。有研究表明，腫瘤(如卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤)處于旺盛時期均出現(xiàn)了IL-6的高表達(dá)[14-15]，作為促炎因子的IL-6可通過自分泌和旁分泌方式促進(jìn)腫瘤發(fā)生，在腫瘤血管生成、腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)及疾病進(jìn)展中起重要作用。此外，在腫瘤微環(huán)境中，TGF-β、IL-6和IL-10可以直接抑制NK細(xì)胞活性，還可以通過影響免疫抑制細(xì)胞和拮抗刺激細(xì)胞因子的作用間接抑制NK細(xì)胞活性，從而抑制NK細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞有機(jī)會逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[16]。培養(yǎng)48 h時細(xì)胞培養(yǎng)上清液未檢測出IL-5、IL-17，可能是因?yàn)镮L-5主要由Th2細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞產(chǎn)生，IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，因此，細(xì)胞培養(yǎng)體系中未檢測到IL-5、IL-17存在，也有可能是這兩種細(xì)胞因子水平過低，采用ELISA雙抗體夾心法沒有檢測出來。本研究采用ELISA雙抗體夾心法檢測細(xì)胞因子，檢測的是可溶性細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)性即細(xì)胞因子的蛋白水平，因此，檢測結(jié)果與細(xì)胞因子的生物活性不一定呈正比。并且測定結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有關(guān)，樣本中存在的各種細(xì)胞因子結(jié)合蛋白也可能對細(xì)胞因子免疫測定產(chǎn)生干擾。

MSCs運(yùn)載Reovirus3在體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中可以有效抑制K562細(xì)胞增殖，除了溶瘤病毒Reovirus3的溶瘤作用外，可能還與培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制K562細(xì)胞的增殖有關(guān)。本課題組荷瘤小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的檢測結(jié)果提示細(xì)胞因子在體內(nèi)對抑制K562細(xì)胞的增殖有一定作用[17]。細(xì)胞因子對腫瘤的作用十分復(fù)雜，隨著人們對各種細(xì)胞因子的來源、生物學(xué)功能、分子結(jié)構(gòu)、相應(yīng)受體和受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面研究取得的進(jìn)展，采用細(xì)胞因子治療或者輔助治療CML受到臨床關(guān)注。