胡開明，王 席，陶 芳，朱 梅

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 238000

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的致死性傳染病。據(jù)WHO估計(jì)，每年新發(fā)結(jié)核病患者1 000萬，約有150萬結(jié)核病患者死亡，位居各種傳染病致死原因之首[1]。早期、準(zhǔn)確識別結(jié)核病對及時(shí)分診、快速啟動(dòng)抗結(jié)核治療，從而控制結(jié)核病傳播有重要意義。目前結(jié)核病診斷試驗(yàn)中，γ干擾素釋放分析因其較高的特異性和敏感性越來越受到重視，已被納入各種診療指南或?qū)＜夜沧R[2-3]，但各種分析報(bào)道有較大差異[4-7]。有研究分析發(fā)現(xiàn)，γ干擾素釋放試驗(yàn)(TSPOT.TB)結(jié)果可能會(huì)受免疫狀態(tài)、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、淋巴細(xì)胞數(shù)等因素影響[8]。本研究在平衡性別、病程、BMI、免疫狀態(tài)等因素后分析不同年齡肺結(jié)核患者TSPOT.TB陽性程度的變化，為該試驗(yàn)在臨床的合理應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年6月至2018年6月入住本院的TSPOT.TB結(jié)果為陽性的245例初治肺結(jié)核患者作為研究對象，所有病例診斷均按照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS288-2017[9]執(zhí)行，其中男198例，女47例；痰涂片和/或培養(yǎng)陽性85例，涂陰160例。TSPOT.TB在入院后1周內(nèi)完成檢測且采集外周血時(shí)未啟動(dòng)抗結(jié)核治療。根據(jù)年齡分為3組，其中青年組(18～44歲)102例，中年組(>44～59歲)39例，老年組(>59歲)104例。分別回顧性分析各組患者性別、BMI、吸煙史、病程(從發(fā)病到檢測間隔時(shí)間)等資料，其中BMI分為<18.5 kg/m2、18.5 kg/m2≤BMI<24 kg/m2及≥24 kg/m23個(gè)等級。所有病例均排除乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人類免疫缺陷病毒感染、惡性腫瘤、妊娠、免疫抑制劑用藥史。

1.2試劑與儀器 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、AIMV細(xì)胞培養(yǎng)液為天津?yàn)笊镏破酚邢挢?zé)任公司產(chǎn)品，TSPOT.TB為英國Oxford Immunotech 公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為三洋公司產(chǎn)品，離心機(jī)為安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3方法 TSPOT.TB： 在抗結(jié)核治療前用肝素鋰抗凝管采集外周靜脈血5 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，洗滌2次后用AIMV細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.5×105/mL。每份待測樣本取出4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，分別加入ESAT-6(抗原A)、 CFP-10(抗原B)、RPMI1640(陰性對照)及 PHA(陽性對照)各50 μL，再加入調(diào)制好的細(xì)胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2環(huán)境孵育16～20 h。取出培養(yǎng)板用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次后加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液(原液用PBS稀釋200倍，用時(shí)配制)4 ℃孵育1 h。洗滌4次后加入50 μL顯色液，避光顯色7 min后，用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后計(jì)數(shù)抗原A孔和抗原B孔的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量(SFCs)，根據(jù)試劑盒說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷試驗(yàn)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25～P75)表示；計(jì)量資料及構(gòu)成比比較分別采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組肺結(jié)核患者臨床資料比較 3組肺結(jié)核患者性別、吸煙史、病程及BMI比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組肺結(jié)核患者臨床資料比較

2.23組肺結(jié)核患者TSPOT.TB的SFCs比較 青年組肺結(jié)核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs分別為49.5(29.5～105.0)、80.0(32.5～151.3)及 138.0(80.3～223.5)；中年組肺結(jié)核患者分別為32.0(18.0～75.0)、37.0(21.0～126.0)及103.0(48.0～206.0)；老年組肺結(jié)核患者分別為15.5(9.0～32.0)、18.5(6.0～49.8)及38.5(21.0～79.5)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，青年組及中年組肺結(jié)核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs均明顯高于老年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組肺結(jié)核患者的SFCs比較

2.33組肺結(jié)核患者不同程度陽性結(jié)果的構(gòu)成分布 根據(jù)SFCs將低于下四分位數(shù)(P75)的結(jié)果定義為強(qiáng)陽性，進(jìn)一步分析年齡與陽性程度之間的關(guān)系。青年組、中年組及老年組肺結(jié)核患者抗原A刺激孔SFCs為弱陽性的構(gòu)成比分別為10.5%、12.3%、77.2%，強(qiáng)陽性的構(gòu)成比分別為67.7%、19.4%、12.9%；抗原B刺激孔SFCs弱陽性的構(gòu)成比分別為21.8%、9.4%、68.8%，強(qiáng)陽性的構(gòu)成比分別為65.6%、21.3%、13.1%；抗原A+抗原B刺激孔SFCs弱陽性的構(gòu)成比分別為3.4%、8.7%、87.9%，強(qiáng)陽性的構(gòu)成比分別為66.7%、20.0%、13.3%。3組肺結(jié)核患者抗原A刺激孔SFCs、抗原B刺激孔SFCs及抗原A+抗原B刺激孔SFCs比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Gmma系數(shù)分別為-0.876、-0.765及-0.945。見表2～4。

表2 3組肺結(jié)核患者TSPOT.TB抗原A刺激孔SFCs結(jié)果陽性程度分布(n)

表3 3組肺結(jié)核患者TSPOT.TB 抗原B刺激孔SFCs結(jié)果陽性程度分布(n)

表4 3組肺結(jié)核患者TSPOT.TB抗原A+抗原B刺激孔SFCs結(jié)果陽性程度分布(n)

3 討 論

中國作為30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，每年新增近90萬活動(dòng)性肺結(jié)核患者[1]。第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺結(jié)核的發(fā)病率隨著年齡增加呈逐漸上升趨勢，在75～80歲達(dá)高峰，菌陽和涂陽肺結(jié)核病例也呈現(xiàn)類似變化趨勢，因此，加強(qiáng)對老年肺結(jié)核患者的診斷和治療對我國結(jié)核病防治工作有積極意義[10]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測方法具有耗時(shí)長、靈敏度低、假陽性高等缺點(diǎn)，再加上老年結(jié)核病患者臨床癥狀常不典型，這些因素都給老年結(jié)核病的診斷帶來一定困難[11-12]。TSPOT.TB是利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，將結(jié)核桿菌特異抗原A和抗原B在體外與PBMC共孵育，通過檢測分泌干擾素-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量判斷機(jī)體有無結(jié)核桿菌感染。多種報(bào)道顯示，TSPOT.TB的敏感性存在較大差異[5-6,13]。進(jìn)一步分析表明，年齡、BMI、病程、人類免疫缺陷病毒感染、人類白細(xì)胞抗原多態(tài)性等因素可能是造成試驗(yàn)敏感性降低甚至呈假陰性的因素[8,14]。本研究在平衡性別、BMI、病程、吸煙史等因素后觀察不同年齡肺結(jié)核患者TSPOT.TB的SFCs變化趨勢，結(jié)果表明，肺結(jié)核患者隨著年齡的增加，抗原A刺激孔、抗原B刺激孔及抗原A+抗原B刺激孔的SFCs均呈下降趨勢，老年組SFCs下降最明顯。

既往研究顯示，隨著年齡增長，免疫系統(tǒng)不可避免地會(huì)發(fā)生衰退，其機(jī)制涉及免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子各種水平，如樹突細(xì)胞對抗原攝取及其成熟能力、外周T細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定及分化、增殖及效應(yīng)分子分泌能力等[15]。動(dòng)物模型研究顯示，老年鼠在感染結(jié)核后，體內(nèi)結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞分泌γ干擾素的能力明顯降低[16]。因此，老年肺結(jié)核患者結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)中檢測斑點(diǎn)數(shù)量下降可能與免疫系統(tǒng)的衰退有關(guān)，這也提示在將此試驗(yàn)用于肺結(jié)核診斷時(shí)應(yīng)考慮年齡因素對試驗(yàn)結(jié)果造成的影響。為了避免此種情況可能造成的漏診，在結(jié)核感染T細(xì)胞試驗(yàn)中引入其他結(jié)核特異性抗原或同時(shí)檢測多種效應(yīng)分子(腫瘤壞死因子-α或白細(xì)胞介素-12)是一種可行的診斷方法。