陳 銳，門 欣，瞿 佳，孫曉宇，趙玲俠

（陜西省微生物研究所微生物菌種資源研究中心，陜西 西安 710043）

【研究意義】多菌靈是廣泛使用的氨基甲酸甲酯類殺菌劑，殘留農(nóng)藥會(huì)進(jìn)入土壤或水體。已有研究表明，殘留于土壤中的多菌靈可改變土壤酶活［1］，影響土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)［2］，降低土壤有機(jī)碳量［3］，增加銨態(tài)氮及硝態(tài)氮量，改變土壤線蟲、蚯蚓等無脊椎動(dòng)物數(shù)量［4］，引起脊柱動(dòng)物氧化應(yīng)激，引起免疫反應(yīng)［5］，產(chǎn)生生殖細(xì)胞毒性及神經(jīng)細(xì)胞毒性［6-7］。針對環(huán)境中多菌靈存在的潛在危害，研究學(xué)者提出利用微生物的生命代謝活動(dòng)，在污染區(qū)域使用微生物菌劑，使污染物得以被吸收或分解［8-9］。在污染土壤中使用生物修復(fù)法可加速污染物的降解，恢復(fù)自然環(huán)境，降低生態(tài)及農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)［10］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)已有報(bào)道篩選獲得各類降解微生物菌株，包括芽孢桿菌（Bacillussp.）、木霉（Trichodermasp.）、假單胞菌（Pseudomonassp.）、紅球菌（Rhodococcussp.）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenessp.）、羅爾斯通氏菌（Ralstoniasp.）等，搖瓶中降解能力最高可達(dá)1 g/L，效率可達(dá)99%。朱鳳曉等［11］報(bào)道紅平紅球菌在土壤室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中，降解多菌靈質(zhì)量濃度為200 mg/L，降解率達(dá)95.2%。在已報(bào)道的土壤試驗(yàn)中所使用的功能菌株部分屬于條件致病菌，部分菌株存在存活時(shí)間短、使用條件苛刻等問題，難以規(guī)?；瘧?yīng)用與開發(fā)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究前期從107 株多菌靈耐受菌中篩選獲得1 株可高效降解多菌靈的菌株WJD-55，經(jīng)HPLC 驗(yàn)證其在沙氏液體培養(yǎng)基中（含多菌靈質(zhì)量濃度500 mg/L），120 h 后可降解多菌靈67%，對照降解率3%，具有顯著差異（T-test，P=0.02）前期試驗(yàn)文獻(xiàn)號(hào)。經(jīng)形態(tài)觀察及ITS 測序，鑒定該菌為致密鏈格孢（Alternaria compacta），回接試驗(yàn)驗(yàn)證該菌不具致病性。該菌株可產(chǎn)生孢子，孢子在室溫條件下存活時(shí)間久，易儲(chǔ)存，便于制劑及規(guī)模化應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為驗(yàn)證多菌靈降解菌WJD-55 在棚室土壤中的應(yīng)用效果，進(jìn)行土壤農(nóng)藥殘留、效能菌株定殖、土壤真菌菌群變化、土壤理化指標(biāo)及作物生長的觀測研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為多菌靈降解菌致密鏈格孢（Alternaria compacta）WJD-55，用無菌生理鹽水制備WJD-55 菌株孢子液（104個(gè)/mL）。麩皮稻殼固體培養(yǎng)基（麩皮300 g，稻殼300 g，水300 mL，豆粕 1.12 g，葡萄糖5 g，大米粉2 g，植物油5 mL，115 ℃滅菌2 h）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌劑W55 制備 麩皮稻殼固體培養(yǎng)基滅菌后平攤于淺盤內(nèi)，上覆4 層無菌紗布，溫度降至30 ℃以下進(jìn)行接種；按照1%的接種量均勻接種，上覆4 層無菌紗布，28 ℃靜置培養(yǎng)，8 d后孢子充分形成。取出培養(yǎng)物后低溫（＜40 ℃）烘干約72 h。在粉碎機(jī)中以間歇模式進(jìn)行粉碎至約0.250 mm 大小。以粉碎物∶麩皮∶高嶺土=1∶5∶4 混合，攪拌均勻，獲得固體粉狀菌劑W55，菌劑自封袋分裝，在常溫條件下保存。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 田間試驗(yàn)于2020 年4 月7 日至5 月27 日在陜西省西安植物園設(shè)施實(shí)驗(yàn)棚室內(nèi)進(jìn)行。劃出4 塊長5 m、寬4 m 試驗(yàn)地，設(shè)W55菌劑對照（菌劑W55 用量400 g/m2）、W55-CA修復(fù)（菌劑W55 用量400 g/m2，多菌靈50%可濕性粉劑0.9 kg，使土壤中多菌靈質(zhì)量終濃度達(dá)到約50 mg/kg）、CA 對照（多菌靈50 %可濕性粉劑0.9 kg，使土壤中多菌靈質(zhì)量終濃度達(dá)到約50 mg/kg）、空白對照（CK）4 個(gè)處理。依照設(shè)計(jì)施入多菌靈及菌劑，翻耕均勻，深度約25 cm。處理后6 d 栽種觀測作物金鵬1 號(hào)番茄苗，14 株/行，6 行/壟，每個(gè)地塊栽種84 株。日常棚室作物田間管理，每隔7～10 d 澆水1 次，栽后35 d 搭設(shè)棚架。

1.2.3 土樣采集 從施用菌劑開始作為0 天，每隔10 d 采集土樣1 次，至處理后50 d 共采樣6 次。5 點(diǎn)采樣法取土，取土深度5～20 cm 合并約1.5 kg作為1 份樣，每塊地采集土樣3 份作為平行，取樣總數(shù)為72 份。每次取樣后立即分成2 份，第1份取10 g 左右，置于15 mL 無菌離心管，-80 ℃冷凍保存，供土壤微生物多樣性測定；余下土壤為第2 份，4 ℃保存，供土壤理化指標(biāo)及土壤中殘留農(nóng)藥含量測定。

為觀測多菌靈隨灌溉水向土壤下層遷移的情況，處理后第10 天起取W55-CA 修復(fù)及CA 對照地塊20～40、40～60 cm 深度土壤樣本，每塊地取3 次合并為1 份，每隔10 d 取樣1 次，至處理后40 d 結(jié)束取樣，進(jìn)行土壤中殘留農(nóng)藥含量測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 土壤殘留多菌靈檢測（1）土壤中多菌靈的提?。喝〈郎y土樣自然風(fēng)干，稱取50 g 于100 mL 具塞三角瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯，振蕩萃取30 min，保留上層萃取液。共萃取3 次，合并濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，分次加入稀鹽酸（1+11）溶解吸出至20 mL 容量瓶，稀鹽酸（1+11）定容，待測。

（2）0.02 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH=6.8）配制：取磷酸二氫鈉1.38 g、磷酸氫二鈉1.41 g 溶于900 mL 水中，用磷酸調(diào)pH 至6.8，定容至1 L。

（3）HPLC 檢測：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，流動(dòng)相：磷酸鈉緩沖液+乙腈（80∶20），流速：1 mL/min，檢測波長：286 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：25 ℃，測定多菌靈的殘留量［11］。

1.3.2 致密格鏈孢WJD-55 在土壤中的定殖 分別稱取W55 對照、W55-CA 處理、CA 對照土壤樣本5 g，加入45 mL 無菌生理鹽水，梯度稀釋，涂布于含100 mg/L多菌靈的沙氏固體培養(yǎng)平板上，28 ℃培養(yǎng) 48 h，觀察平板上菌落的生長。挑取10個(gè)形態(tài)不同的真菌菌落至沙氏平板進(jìn)行劃線純化（當(dāng)平板上的真菌菌落合計(jì)不足10 個(gè)則選取全部菌落）。待單一菌落形成后取菌體進(jìn)行液氮研磨，提取基因組。使用ITS1、ITS4 引物進(jìn)行序列擴(kuò)增并測序鑒定，統(tǒng)計(jì)致密格鏈孢被檢出的次數(shù)。

1.3.3 土壤真菌多樣性監(jiān)測 將保存于-80 ℃的W55-CA 處理、CA 對照及CK 3 個(gè)地塊處理后0、10、20、30、40 d 的土壤樣本，委托聯(lián)川生物公司（Omicstudio）通過土壤微生物ITS V3-4 區(qū)高通量測序分析土壤真菌多樣性變化。

1.3.4 土壤理化指標(biāo)監(jiān)測 將W55 對照、W55-CA 修復(fù)處理、CA 對照、CK 處理的土壤樣本送至中國科學(xué)研究院水土保持研究所測定土壤含水量、含鹽量、pH、NPOC、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、微生物氮、全磷、速效磷、速效鉀、土壤團(tuán)粒等土壤理化指標(biāo)。

1.3.5 作物生長監(jiān)測 從番茄種下第2 天起開始測定番茄苗株高及葉片大小。隨機(jī)選取5 株番茄苗測定株高，隨機(jī)選中段分枝5 條測量第1 葉片大小，觀測葉片是否有異常色斑等病變。每隔10 d 測定1 次，至50 d 結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 致密鏈格孢WJD-55 對土壤多菌靈殘留量的影響

通過乙酸乙酯萃取及HPLC 測定，結(jié)果如圖1 所示，初始摻入土壤的多菌靈質(zhì)量濃度約42 mg/kg。處理后10 d，W55-CA 修復(fù)處理多菌靈殘留質(zhì)量濃度為9.27 mg/kg、殘留率22%，CA對照土壤多菌靈殘留質(zhì)量濃度為30.20 mg/kg、殘留率71%，二者具有極顯著差異（T-test，P=0.001）；處理后20 d，W55-CA 修復(fù)處理多菌靈殘留量為0，CA 對照多菌靈殘留質(zhì)量濃度為11.84 mg/kg，殘留率28%；處理后30 d，CA 對照多菌靈殘留質(zhì)量濃度為2.15 mg/kg；處理后40 d，W55-CA修復(fù)處理及CA對照多菌靈殘留量均為0。

圖1 表層5～20 cm 土壤多菌靈殘留率Fig.1 Residue rate of carbendazim in 5-20 cm soil

在田間日常管理中需要定期給作物充分的灌溉，為了解土壤中多菌靈是否隨灌溉的水分向下遷移至更深層的土壤中，對20～40、40～60 cm 兩個(gè)深度的土壤進(jìn)行殘留多菌靈的測定。結(jié)果（表1）顯示，處理后10、20 d，CA 對照20～40、40～60 cm的土壤中均檢出多菌靈殘留，而W55-CA 修復(fù)處理均為0，表明土壤中的多菌靈會(huì)隨灌溉水向下遷移，施用修復(fù)菌劑W55 后，可迅速降解土壤中的多菌靈，有效阻止其向更深層土壤遷移。

表1 深層20～40、40～60 cm 土壤中多菌靈的殘留量Table 1 Residue content of carbendazim in 20-40 cm and 40-60 cm soil

2.2 致密鏈格孢WJD-55 在土壤中的定殖

降解菌能否在土壤中定殖決定了其在土壤中能否有效發(fā)揮作用。為觀測WDJ-55 菌株在修復(fù)過程中在土壤中的定殖情況，嘗試重新從土壤中分離培養(yǎng)可耐受多菌靈的真菌微生物，結(jié)果如圖2 所示，W55-CA 修復(fù)處理的土壤真菌菌落較多，而W55 對照真菌菌落形成數(shù)量不穩(wěn)定，CA 對照在處理后30、40、50 d 有較少菌落形成。

圖2 致密格鏈孢WDJ-55 在土壤中的定殖Fig.2 Colonization of Alternaria compacta WDJ-55 in soil

挑取真菌菌落進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果如表2 所示，W55-CA 修復(fù)處理的土壤可持續(xù)檢測出致密格鏈孢，而W55 對照隨修復(fù)天數(shù)有所降低，CA對照則一直未檢出。初步確定致密鏈格孢W55 可有效定殖于含多菌靈土壤而難以定殖于不含多菌靈土壤中。

表2 致密格鏈孢測序檢出情況Table 2 Detection of Alternaria compacta in by sequencing

在平板中已檢測到一定數(shù)量的致密鏈格孢菌落生長，通過高通量測序分析可以更加準(zhǔn)確地了解降解菌WJD-55 在土壤中的定殖情況。由圖3可知，W55-CA 修復(fù)處理的土壤鏈格孢屬優(yōu)勢菌群，CA 對照及CK 有小比例鏈格孢屬、應(yīng)屬于土壤本源鏈格孢屬，而CA 對照鏈格孢比例隨天數(shù)降低，可見土壤本源鏈格孢屬不耐受多菌靈，引入的菌劑WJD-55 在土壤中可以穩(wěn)定定殖直至修復(fù)后期。

圖3 格鏈孢屬在土壤中的相對豐度Fig.3 Relative abundance of Alternaria sp.in soil at genus level

2.3 致密鏈格孢WJD-55 對土壤真菌多樣性的影響

多菌靈作為一種微生物抑制劑，對土壤微生物多樣性的影響已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，通過高通量測序?qū)ν寥勒婢旱淖兓M(jìn)行觀測，土壤真菌微生物α-多樣性如圖4 所示，施用多菌靈土壤的Chao1、Otus、Shannon、Simpson 指數(shù)均比CK低，說明土壤真菌微生物豐富度及均一度都顯著降低，隨著W55-CA 修復(fù)天數(shù)的增加，W55-CA修復(fù)處理的土壤真菌微生物多樣性比CA 對照恢復(fù)快，說明菌劑的加入有利于污染土壤真菌微生物多樣性的恢復(fù)。

圖4 土壤真菌微生物多樣性指數(shù)Fig.4 Diversity index of fungal microorganism in soil

土壤真菌微生物菌群組成差異變化如圖5 所示，CA 對照土壤真菌菌群多樣性顯著降低，無法分類的類群比例逐漸增加，至處理后40 d，土壤真菌接近80%的菌群成為無法分類類群，表明多菌靈對土壤微生物群落有顯著的影響；而在加入多菌靈的土壤中施用菌劑，多菌靈對土壤真菌菌群的影響則顯著降低。

圖5 屬水平修復(fù)期土壤真菌群落聚類Fig.5 Fungi colony cluster of soil at genus level during remediation period

2.4 致密鏈格孢WJD-55 對土壤理化指標(biāo)的影響

5～20 cm 土層土壤的基本理化性質(zhì)如表3 所示，由于在菌劑使用過程中引入了麩皮等有機(jī)物質(zhì)，W55 對照、W55-CA 修復(fù)處理土壤的有機(jī)質(zhì)、N、P、K 水平比CA 對照和CK 高，分析認(rèn)為這些指標(biāo)的提高不是微生物菌株本身發(fā)揮的作用，而可能是菌劑中的輔料提供了部分影響，微生物WDJ-55 對土壤性質(zhì)產(chǎn)生影響的可能性較低。

表3 土壤理化指標(biāo)Table 3 Soil physical and chemical indexes

（續(xù)表3）

2.5 致密鏈格孢WJD-55 對作物生長的影響

由圖6 可知，W55-CA 修復(fù)處理、W55 對照、CA 對照、CK 對番茄植株及葉片的生長均無顯著差異，番茄葉片上未觀察到有任何病變，后期掛果及產(chǎn)果過程中也未觀察到顯著差異，表明多菌靈及菌劑對作物生長無不良影響。

圖6 菌劑W55 對作物生長的影響Fig.6 Effects of microbial agent W55 on crop growth

3 討論

農(nóng)藥的廣泛使用雖然減少了病害發(fā)生，保證農(nóng)作物產(chǎn)量，但過度使用造成土壤殘留對環(huán)境、生態(tài)安全及人類健康產(chǎn)生負(fù)面影響。農(nóng)藥施用后，未能及時(shí)自然降解的殘留部分或被動(dòng)植物吸收，或殘留于土壤、大氣、地表、地下水中［12］。近年來在土壤［13］、農(nóng)產(chǎn)品［14］中廣泛檢出多菌靈殘留，在我國地表、地下水中檢出的地域也極為廣泛，自北京、天津［15］直至太湖［16］、黃浦江流域［17］都有報(bào)道，且檢出率幾乎為100%。

研究表明，多菌靈是通過作用于真菌的β微管蛋白來發(fā)揮其殺菌作用，敏感性由β 微管蛋白對多菌靈的差異親和力決定［18］。但β 微管蛋白廣泛存在于所有真核生物，并且進(jìn)化較為保守，因此多菌靈亦具有生殖毒性及神經(jīng)毒性［19-20］，通過阻滯植物細(xì)胞有絲分裂繼而影響植物的正常生長［21］，威脅自然生態(tài)中的魚類、鼠類及昆蟲的生存。對人類健康也會(huì)產(chǎn)生一定影響，通過降低G0/G1 期細(xì)胞的百分比誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］，對肝細(xì)胞產(chǎn)生肝毒性損傷［23］，慢性多菌靈暴露會(huì)引起腸道菌群失調(diào)和脂質(zhì)代謝紊亂［24］。多菌靈殘留對于農(nóng)業(yè)土壤影響最為顯著，它可以顯著改變土壤細(xì)菌［25］及真菌的菌群結(jié)構(gòu)［26］。本研究中，高通量測序結(jié)果顯示微生物真菌的多樣性受多菌靈的影響逐步降低，無法分類的比例顯著增加。在修復(fù)菌劑的作用下，前期菌多樣性有一定下降趨勢，而后逐步得以恢復(fù)，但在處理后40 d 尚未達(dá)到對照水平，土壤具有抗性的真菌數(shù)量顯著增加［27］，耐藥性病害真菌數(shù)量也顯著增加［28-31］，并且由于多菌靈的存在增強(qiáng)了病害真菌的毒性［32］。研究表明，通過宏基因組測序法對比溫室和山區(qū)土壤樣本，含有殺真菌劑的溫室土壤比山區(qū)土壤具有更多樣和豐富的抗殺菌劑基因，并且溫室土壤中的抗性基因多集中于腸桿菌中［33］。本研究前期在多年設(shè)施棚室中也分離出大量的腸桿菌及其他條件致病菌。條件致病菌在土壤應(yīng)用中會(huì)存在潛在安全問題，因此并不適合作為土壤殘留農(nóng)藥微生物菌劑的出發(fā)菌株。

殘留于環(huán)境中的多菌靈經(jīng)過土壤本源微生物的作用亦會(huì)逐漸分解［34］，外源引入可降解化學(xué)農(nóng)藥的微生物菌劑可以加速降低土壤中殘留農(nóng)藥的水平，使土壤快速恢復(fù)健康水平，恢復(fù)土壤微生物的多樣性，降低土壤微生物病原微生物數(shù)量及抗性基因，減少殘留農(nóng)藥向水體及其他生物體內(nèi)的遷移量。

目前報(bào)道具有多菌靈降解特性的微生物有芽孢桿菌［35］、蒼白桿菌［36-37］、克雷伯氏菌、單胞菌［38］、金黃色葡萄球菌［39］、分枝桿菌［40］等。在土壤中驗(yàn)證其效果的微生物有枯草芽孢桿菌［35］，該菌可加速土壤中多菌靈的降解；金黃色葡萄球菌［39］可在液體及土壤中將200 mg/L的多菌靈完全降解；木霉［41］可將土壤中100 mg/kg 多菌靈在6 d 內(nèi)完全降解。但部分已報(bào)道的可降解多菌靈的微生物部分屬于人條件致病菌，如金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌等，并不適合實(shí)際應(yīng)用。本研究使用的效能菌株致密格鏈孢（A.compacta）屬于絲狀真菌，回接試驗(yàn)證實(shí)不具有致病性，產(chǎn)生的孢子可在室溫條件下保存1 年以上，利于制劑及規(guī)?；瘧?yīng)用，經(jīng)土壤降解效果及安全性驗(yàn)證后，下一步將開展其降解機(jī)制及適用范圍研究。

4 結(jié)論

本研究通過在多菌靈污染土壤中施用修復(fù)菌劑W55，初始多菌靈土壤含量約42 mg/L，使用菌劑0.1%處理后10 d，修復(fù)處理土壤多菌靈殘留量為9.27 mg/kg、殘留率22%，而對照土壤多菌靈殘留量為30.20 mg/kg、殘留率71%，具有極顯著差異（T-test，P=0.001）。表明菌劑W55 可有效加速多菌靈在土壤中的降解。土壤微生物高通量測序結(jié)果顯示降解菌WJD-55 可在多菌靈污染土壤中定殖，并可彌補(bǔ)多菌靈對土壤微生物多樣性產(chǎn)生的負(fù)面影響；土壤理化指標(biāo)顯示菌劑的加入未對土壤物理化學(xué)性質(zhì)帶來顯著影響；觀測作物番茄生長未受到菌劑的任何影響。通過土壤殘留多菌靈的測定，土壤真菌微生物多樣性測序、土壤理化指標(biāo)測定以及作物生長觀測結(jié)果均表明，多菌靈降解菌WJD-55 可在土壤中穩(wěn)定定殖并發(fā)揮降解多菌靈的作用，在番茄種植土壤中使用該菌劑安全有效。