包仲明 文黛薇 陸品剛 黃舞標(biāo) 唐國文

1.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，廣西梧州 543002；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第六附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西梧州 543002；3.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，廣西梧州 543002；4.廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，廣西梧州 543002

帕金森病便秘是指帕金森病患者的一種非運(yùn)動(dòng)癥狀，病因主要是腸胃蠕動(dòng)功能下降，給患者生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重的不良影響[1]。帕金森病患者中很大一部分會(huì)發(fā)生便秘，即使不發(fā)生便秘，也有部分患者發(fā)生排便頻率降低。帕金森病便秘原因比較復(fù)雜，可能由多種原因引起，帕金森病本身可能會(huì)伴隨便秘，也可能因服用治療帕金森病藥物副作用而加重便秘的癥狀。因此帕金森病便秘可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物治療、飲食變化或體力活動(dòng)有限有關(guān)[2]。中藥具有多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢，在帕金森病便秘的治療中具有良好的前景[3]，但其具體的作用機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步探討。全國老中醫(yī)藥專家文黛薇教授認(rèn)為脾胃是氣機(jī)升降的樞紐，人體精氣的升降運(yùn)動(dòng)有賴于脾胃居于其中而主宰。人以脾胃為后天之本，若脾胃受損，氣血化生障礙，元?dú)獠怀?，正虛邪犯，百病由生。由此可見，中焦脾胃能影響其余諸臟的生理功能，中氣足則四臟皆健，脾胃旺以安五臟。故在臨證中，應(yīng)謹(jǐn)遵“調(diào)治百病，扶土為先”之旨，將其應(yīng)用于諸多疾病的診治過程中，并始終重視顧護(hù)脾胃。白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方可在健脾胃益氣基礎(chǔ)上，治療帕金森病便秘癥狀[4]。因此，本研究擬結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方治療帕金森病便秘作用機(jī)制并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方的化合物及其作用靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中分別檢索白術(shù)、黃芪和枳實(shí)的活性化合物，篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[7-13]，對(duì)化合物進(jìn)行篩選。在TCMSP 中查找各有效化合物所對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)，用于后續(xù)分析。

1.2 帕金森病便秘靶點(diǎn)基因收集

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“帕金森病便秘”為關(guān)鍵詞檢索其相關(guān)基因，與白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方中有效化合物作用的靶點(diǎn)基因進(jìn)行比較，篩選出白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方用于帕金森病便秘的作用靶點(diǎn)并繪制韋恩圖，靶點(diǎn)基因用于后續(xù)生物功能及信號(hào)通路分析。

1.3 有效靶點(diǎn)基因及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

構(gòu)建白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方化合物-帕金森病便秘的靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化，初步分析白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方治療帕金森病便秘的作用機(jī)制。同時(shí)將有效靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫中，選擇“人”作為物種，以靶點(diǎn)蛋白互作評(píng)分＞0.7 為標(biāo)準(zhǔn)，獲取有效靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 有效靶點(diǎn)GO 富集分析及KEGG 通路分析

將白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方的靶點(diǎn)輸入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID），對(duì)篩選所得化合物靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析。利用KEGG Mapper功能將白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方化合物作用靶點(diǎn)在其與帕金森病便秘相關(guān)的作用通路上標(biāo)注。

1.5 藥物及試劑

白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方濃縮液（方藥組成如下：白術(shù)40 g、黃芪15 g、枳實(shí)15 g），由廣西壯族自治區(qū)梧州市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，該組方經(jīng)煎煮后濃縮，使每1 ml 濃縮液中含2 g 生藥。洛哌丁胺（中國藥品檢驗(yàn)總所，批號(hào)：100300）、美多芭（上海羅氏）、聚乙二醇（馬應(yīng)龍藥業(yè)，批號(hào)：20082092）。RNA 提取試劑盒（廣州美基公司，批號(hào)：R4121-02B）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM，批號(hào)：RR055A/B）、PCR 引物（美國賽默飛，批號(hào)：450006）。絲裂原激活蛋白激酶8（mitogen-activation protein kinase 8，MAPK8）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、MYC、胱天蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease 3，Caspase3）一抗（北京中杉金橋，TA809895、TA500067、TA336584、TA336456）。

1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、造模及干預(yù)

選取6 周齡健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠20 只，平均體重（180±20）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可：SCXK 桂2020-0003，使用許可：SYXK 桂2020-0004），其中5 只為正常組，15 只采用雙靶點(diǎn)注射6-羥基多巴胺，建立帕金森病模型，注射藥物3 周后，大鼠逐漸開始出現(xiàn)毛色變黃、弓背、震顫、步態(tài)不穩(wěn)等帕金森病表現(xiàn)，4 周后其行為學(xué)評(píng)分均達(dá)到2 分以上為造模成功[5]。進(jìn)一步使用洛哌丁胺3 mg/kg，1 ml 生理鹽水稀釋后進(jìn)行灌胃6 d[6]。于末次給藥2 h后，20 只大鼠均灌胃5%活性炭-阿拉伯樹膠懸液，灌胃后記錄首粒黑便的排出時(shí)間，當(dāng)15 只帕金森病模型大鼠的首粒黑便平均排出時(shí)間長于正常組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）時(shí)，視為帕金森病便秘模型造模成功。本研究涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究過程遵循《赫爾辛基宣言》有關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究的倫理要求。

將15 只帕金森病便秘模型大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組各5 只。實(shí)驗(yàn)組給予10 ml/kg 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方濃縮液灌胃；陽性對(duì)照組給予美多芭50 mg/kg和聚乙二醇1 mg/kg進(jìn)行灌胃；正常組、模型組用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，均1 次/d，持續(xù)2 周。最后用2.5 ml/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，處死并取結(jié)腸組織。

1.7 mRNA表達(dá)檢測

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果及參考文獻(xiàn)[14-15]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測四組結(jié)腸組織中相關(guān)基因表達(dá)量。試劑盒提取四組結(jié)腸組織中相關(guān)mRNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為參考。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT-PCR 進(jìn)行擴(kuò)增及定量分析。

1.8 Western blot 檢測

取四組結(jié)腸組織于低溫冰盒內(nèi)剪碎后并裂解，根據(jù)BCA 法測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入稀釋相關(guān)基因的一抗，按1∶200 稀釋后至于4℃冰箱中孵育過夜，洗膜后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，至于37℃恒溫箱中孵育1 h。顯影后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析，用β-actin 蛋白進(jìn)行校正。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用Tukey 法進(jìn)行兩兩比較。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)、黃芪和枳實(shí)的活性生物化合物

白術(shù)、黃芪和枳實(shí)共收集到50 種活性生物化合物，主要包括3β-acetoxyatractylone、quercetin和naringenin等。見表1。

表1 白術(shù)、黃芪和枳實(shí)中篩選的50 種活性生物化合物

2.2 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方的靶點(diǎn)篩選

白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方作用靶點(diǎn)共2448 個(gè)，篩選的活性化合物相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共116 個(gè)，帕金森病便秘相關(guān)的靶點(diǎn)共2559 個(gè)，二者取交集后得到白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方可能作用于帕金森病便秘的靶點(diǎn)84 個(gè)。見圖1、表2。

表2 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方可能作用于帕金森病便秘靶點(diǎn)

圖1 帕金森病便秘與白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方作用靶點(diǎn)交集的韋恩圖

2.3 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方活性化合物-帕金森病便秘靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方與帕金森病便秘之間的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中共有114 個(gè)節(jié)點(diǎn)，見圖2。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中相互作用節(jié)點(diǎn)共648 個(gè)，將蛋白連接節(jié)點(diǎn)最多的蛋白以柱狀圖的形式表示，相互作用節(jié)點(diǎn)最多的為MAPK8，共58 個(gè)，見圖3。

圖2 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方活性化合物-帕金森病便秘作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方與帕金森病便秘作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.4 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方-帕金森病便秘靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析

GO 分析共富集到111 條生物過程，主要包括泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡、核受體活性等生物過程，見圖4（封三）。KEGG 分析富集結(jié)果顯示白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方靶點(diǎn)主要富集在PI3K-Akt、Hepatitis B、MAPK和neurodegenerationmultiple diseases 等信號(hào)通路上，見圖5（封三）。

圖4 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方與帕金森病便秘相關(guān)靶點(diǎn)GO 富集分析圖

圖5 白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方與帕金森病便秘相關(guān)靶點(diǎn)信號(hào)通路氣泡圖

2.5 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表達(dá)量比較

模型組MAPK8 基因表達(dá)量均低于正常組，IL-6、MYC、Caspase3 基因表達(dá)量均高于正常組，實(shí)驗(yàn)組MAPK8 基因表達(dá)量高于模型組，IL-6、MYC、Caspase3基因表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見圖6。

圖6 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 基因表達(dá)量比較

2.6 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達(dá)量比較

模型組MAPK8 蛋白表達(dá)量低于正常組，IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達(dá)量均高于正常組，實(shí)驗(yàn)組MAPK8 蛋白表達(dá)量高于模型組，IL-6、MYC、Caspase3蛋白表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見圖7。

圖7 四組MAPK8、IL-6、MYC、Caspase3 蛋白表達(dá)量比較

3 討論

便秘是帕金森病患者最容易出現(xiàn)的腸道并發(fā)癥，同時(shí)也有研究表明便秘作為帕金森病的非運(yùn)動(dòng)癥狀，會(huì)早于帕金森病運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)[16]。便秘的加重會(huì)導(dǎo)致帕金森病病情的加重，同時(shí)便秘也是部分藥物治療帕金森病的副作用之一[17]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)和醫(yī)學(xué)的綜合學(xué)科，在“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的基礎(chǔ)上，利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，可以系統(tǒng)地分析藥物對(duì)疾病的干預(yù)作用，揭示藥物多分子協(xié)同作用于人體的機(jī)制，這與中醫(yī)藥復(fù)方治療疾病多靶點(diǎn)有異曲同工之處，可以科學(xué)地分析中藥復(fù)方對(duì)疾病的作用機(jī)制[18]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析顯示，白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方作用的靶點(diǎn)具有多樣性，顯示了中醫(yī)“異病同治”的理論，同時(shí)也提示“扶土為先”理論的科學(xué)性，可從脾胃論治腦病。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得出節(jié)點(diǎn)最多的MAPK8、IL-6 等靶點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)確與帕金森病便秘存在相關(guān)性[19-22]。生物學(xué)功能GO 分析中，與白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方作用靶點(diǎn)生物過程相關(guān)聯(lián)的有泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等，與帕金森病便秘的發(fā)展有相關(guān)性[23-25]。KEGG 信號(hào)通路分析得出，白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方作用靶點(diǎn)主要參與的信號(hào)通路有PI3KAkt、Hepatitis B、MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 等，研究表明與帕金森病便秘相關(guān)[26]，同時(shí)也與脾胃疾病存在密切的關(guān)系[27]，由此也從信號(hào)通路說明了可通過“扶土為先”論治帕金森病便秘。MAPK和neurodegeneration-multiple diseases 信號(hào)通路也與帕金森病便秘密切相關(guān)[28-29]。Hepatitis B 信號(hào)通路與帕金森病便秘也存在高度相關(guān)，可能是其危險(xiǎn)因素或共用信號(hào)通路[30]。

由于使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥對(duì)疾病的機(jī)制仍有其局限性，因此，本研究還通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)，選取MAPK8、IL-6、MYC 及Caspase3 基因及其蛋白表達(dá)量進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK8 是白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方治療帕金森病便秘中的最主要節(jié)點(diǎn)，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸中MAPK8的基因表達(dá)量高于模型組，提示MAPK8 極可能為帕金森病便秘中的關(guān)鍵的基因，可將腦和腸聯(lián)系起來。而實(shí)驗(yàn)組中IL-6、MYC 及Caspase3的基因表達(dá)量均低于模型組，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8,31-32]。

文黛薇教授為第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師之一，行醫(yī)數(shù)十載，一直重視脾胃，認(rèn)為脾胃乃后天之本，化生之源，強(qiáng)調(diào)“調(diào)治百病、扶土為先”的學(xué)術(shù)思想，在內(nèi)科疾病診治方面逐步形成一套辯證思維方法和臨床醫(yī)療經(jīng)驗(yàn)。文黛薇教授指出，脾胃為“倉廩之官”“水谷之?！薄昂筇熘尽薄Ｋ^“本”，是指脾主運(yùn)化，生血、統(tǒng)血，為氣血生化之源，氣機(jī)升降的樞紐，是保證生命活力的源泉。同時(shí)腦髓由水谷精微中至清至精者所化，所以文黛薇教授認(rèn)為脾胃與腦關(guān)系密切，腦病的諸多癥狀，皆可從脾胃而論治。《傷寒論》中有提到“若大便堅(jiān)，小便自利者，去桂加白術(shù)湯主之”，同時(shí)也有研究表明白術(shù)能促進(jìn)腸道平滑肌蠕動(dòng)，說明白術(shù)不僅可以益氣健脾，同時(shí)也是治療便秘的對(duì)癥中藥[33-34]。黃芪能補(bǔ)氣健脾、益氣固表，同時(shí)能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善便秘的癥狀[35-36]。枳實(shí)具有調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、抗氧化、消炎鎮(zhèn)痛等作用，多用于消化系統(tǒng)疾病的治療。白術(shù)和黃芪“以補(bǔ)為通”，補(bǔ)虛而不壅滯，通腑而不傷正，同時(shí)結(jié)合枳實(shí)，辛散溫通，破氣消積，消補(bǔ)結(jié)合，一走一守，相互制約，相互為用，以達(dá)補(bǔ)而不滯，消而不散的功效。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)白術(shù)、黃芪、枳實(shí)的活性成分對(duì)帕金森病便秘的作用靶點(diǎn)和機(jī)制進(jìn)行機(jī)制初步探討，結(jié)果顯示白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方治療帕金森病便秘，作用靶點(diǎn)最主要的信號(hào)通路為MAPK8等，與“扶土為先”理論殊途同歸，提示白術(shù)-黃芪-枳實(shí)組方可能通過健脾扶土治療帕金森病便秘。