袁慶鋒 張 琪 楊云杰

四川省巴中市中心醫(yī)院胸心外科，四川巴中 636000

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。我國是食管癌高發(fā)的國家之一，每年新發(fā)病例達(dá)24.6 萬例，發(fā)病率為17.9/10 萬，死亡率為13.7/10 萬[1]。目前食管癌的治療包括手術(shù)、放化療等，但部分患者即使經(jīng)積極治療后，仍易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展[2]。Ⅲ型纖連蛋白樣包含結(jié)構(gòu)域1（Ⅲtype fibronectin like inclusion domain 1，F(xiàn)NDC1）基因位于6q25.3，屬于纖連蛋白家族成員，在表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用[3]。研究表明，F(xiàn)NDC1 在高血壓[4]、心肌梗死[5]及腫瘤[6]等疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控作用，其可以通過促進(jìn)下游基因的高甲基化促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖等生物學(xué)行為，影響疾病的發(fā)生發(fā)展。最近的一項(xiàng)研究[7]發(fā)現(xiàn)FNDC1 在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)較高，過表達(dá)FNDC1 后能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移。本研究通過分析食管癌中FNDC1的表達(dá)及臨床意義，為發(fā)現(xiàn)潛在的食管癌腫瘤標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年4 月至2015 年4 月四川省巴中市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治的食管癌患者93例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為初次診治；②根據(jù)病理學(xué)檢查明確診斷，由2 位病理醫(yī)師共同閱片。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并食管狹窄、反流性食管炎及食管結(jié)核等食管良性疾?。虎诤喜?yán)重心肺肝腎等臟器功能障礙；③合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫系統(tǒng)疾??；④既往有惡性腫瘤病史及治療史。本研究均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書，本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。所有食管癌患者自確診之日起開始隨訪，以電話方式，每3 個(gè)月隨訪1 次，隨訪5 年，隨訪內(nèi)容為患者生存情況。隨訪截止至2020 年5 月，隨訪終點(diǎn)為患者復(fù)發(fā)或隨訪結(jié)束。

1.2 熒光定量PCR 檢測組織中FNDC1的表達(dá)

應(yīng)用Trizol 法提取組織中總RNA，Narodrop 檢測RNA的濃度和純度。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根公司，貨號：KR123。反應(yīng)體系：SYBR Green premix 10 μl，正向及反向引物各1 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。FNDC1的正向引物序列：5’-GCCAAGGCATGTGAAACTG-3’，反向引物序列：5’-CTGGTAGCATCTTTGGGTGGG-3’，以GAPDH 為內(nèi)參，GAPDH正向引物序列5’-ACCCAAAGAT-GCTACCAGTAGA-3’，反向引物序列：5’-AGCAGCA-CAAAGTACACTACC-3’。采用2-△Ct法表示組織中FNDC1的相對表達(dá)量。

1.3 免疫組化檢測組織中FNDC1 蛋白表達(dá)

將組織用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟；梯度水化；高壓鍋檸檬酸緩沖液抗原熱修復(fù)；3%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶；5%羊血清，室溫封閉30 min；一抗4℃孵育過夜（FNDC1 稀釋比1∶200，購自abcam 公司，貨號：174833）；二抗，室溫2 h；DAB 顯色3 min；蘇木精染核30 s（小鼠/兔超敏聚合物法檢測二步法通用試劑盒購自北京中衫金橋公司，貨號：PV-8000）；梯度脫水后封片鏡檢。染色結(jié)果結(jié)合高倍鏡視野（200×）下染色強(qiáng)度評估，不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色顆粒為2 分，棕黃色為3 分。每個(gè)標(biāo)本取5 個(gè)視野，結(jié)果取平均值。0～1 分判定為染色陰性，2～3 分為染色陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用R×C 列表χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 檢驗(yàn)）食管癌組織中不同F(xiàn)NDC1表達(dá)的預(yù)后生存差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌及癌旁組織中FNDC1 mRNA表達(dá)比較

食管癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達(dá)量為（2.12±0.35），癌旁組織中的相對表達(dá)量為（1.04±0.20）。癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織（t=25.837，P=0.000）。

2.2 食管癌及癌旁組織中FNDC1 蛋白表達(dá)比較

FNDC1 陽性棕褐色染色主要位于癌組織中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿。腫瘤組織中FNDC1 蛋白的陽性表達(dá)率為66.7%（62/93），癌旁組織中為10.8%（10/93）。癌組織中FNDC1 蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織（χ2=61.275，P=0.000）。見圖1（封四）。

圖1 免疫組化檢測食管癌及癌旁組織中FNDC1蛋白表達(dá)(200x)

2.3 癌組織中FNDC1的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

癌組織中FNDC1的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（均P ＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置及病理分級無關(guān)聯(lián)（均P ＞0.05）。見表2。

表2 癌組織中FNDC1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 癌組織中FNDC1的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系

本研究中，93 食管癌患者隨訪3～60 個(gè)月，平均隨訪時(shí)間（26.1±11.2）個(gè)月，隨訪期間死亡74例，存活19例，期間無失訪病例。5 年總體生存率（OS）為20.4%（19/93）。FNDC1 陽性和陰性患者的5 年OS 分別為6.5%（4/62）、48.4%（15/31）。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 檢驗(yàn)）結(jié)果FNDC1 陽性患者5 年OS顯著低于陰性患者（χ2=4.557，P=0.032），F(xiàn)NDC1 陽性平均生存時(shí)間為（18.4±5.7）個(gè)月，而FNDC1 陰性患者平均生存時(shí)間為（29.6±6.2）個(gè)月，F(xiàn)NDC1 陽性患者的平均生存時(shí)間顯著短于FNDC1 陰性患者（t=8.675，P <0.001）。見圖2。

圖2 癌組織中FNDC1的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系

3 討論

食管癌是癌癥相關(guān)死亡的第六大原因，世界范圍內(nèi)每年新確診患者例數(shù)達(dá)45 萬，其發(fā)病率呈不斷增加的趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[8-11]。部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，喪失手術(shù)最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后不佳[12-15]。因此有必要深入研究食管癌疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括種族、飲食、飲酒、遺傳易感性等，特別是環(huán)境因素導(dǎo)致的遺傳學(xué)改變、表觀遺傳學(xué)改變是食管癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的機(jī)制。

FNDC1 屬于FNDC 家族成員，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC1參與組織發(fā)育、細(xì)胞黏附、遷移和增殖等生物學(xué)過程[16-17]。有學(xué)者報(bào)道，在肺動(dòng)脈高壓、惡性腫瘤等多種疾病中，F(xiàn)NDC1 能夠激活細(xì)胞表面受體G 蛋白信號傳導(dǎo)8（AGS8），促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[18-19]。本研究中，食管癌癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達(dá)量及FNDC1 蛋白表達(dá)陽性率均顯著高于癌旁組織。目前食管癌中FNDC1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。分析其可能機(jī)制，一方面與FNDC1 受微小RNA（miRNA）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)[20-21]。有研究報(bào)道，miR-1207-3p 能夠結(jié)合FNDC1 mRNA的3’端非編碼區(qū)，降低FNDC1 mRNA的穩(wěn)定性，抑制FNDC1的表達(dá)，而腫瘤中miR-1207-3p表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致FNDC1的表達(dá)水平升高。另一方面，腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子β表達(dá)水平升高能夠激活皮質(zhì)類固醇受體，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞FNDC1的表達(dá)[22]。本研究中，癌組織中FNDC1的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FNDC1的表達(dá)促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制與FNDC1 參與表皮生長因子（vascular epidermal growth factor，VEGF）介導(dǎo)的血管及淋巴管生成中的重要作用有關(guān)。有研究報(bào)道，F(xiàn)NDC1 能夠激活細(xì)胞表面受體AGS8，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的亞細(xì)胞分布，促進(jìn)VEGF-A 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤分期升高[18]。此外，F(xiàn)NDC1 激活A(yù)GS8 后，參與腫瘤細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)，VEGF-C 通過促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中蛋白激酶B的磷酸化，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和淋巴管形成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移[23]。以往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中FNDC1的表達(dá)與腫瘤患者的生存預(yù)后關(guān)系密切，其表達(dá)水平有助于預(yù)測患者的生存預(yù)后情況[24]。因此，為進(jìn)一步分析食管癌中FNDC1表達(dá)的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FNDC1陽性表達(dá)的食管癌患者5 年OS 及平均生存時(shí)間均較陰性表達(dá)患者明顯縮短，提示食管癌組織中FNDC1的表達(dá)有助于預(yù)測食管癌患者的生存預(yù)后，有可能成為判斷食管癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。以往有學(xué)者在胃癌中亦發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)FNDC1的患者生存預(yù)后較差，其原因是FNDC1表達(dá)水平的升高會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移等惡性生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展低[25]，患者對治療的反應(yīng)差，導(dǎo)致預(yù)后不佳[26-27]。

綜上所述，食管癌組織中FNDC1表達(dá)上調(diào)，食管癌中FNDC1的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且FNDC1的表達(dá)與患者的不良生存預(yù)后有關(guān)，有望成為新的判斷食管癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物及潛在治療靶標(biāo)。