王菲菲，袁風嬌，楊玉嬌，路 岳，李 軍，賈殿隆，柳仁民

(1. 聊城大學 藥學院，山東 聊城 252059；2. 聊城市人民醫(yī)院 轉化醫(yī)學研究聯(lián)合實驗室，山東，聊城，252000)

0 引言

特異性誘導腫瘤細胞凋亡是一種關鍵的抗癌策略[1]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族成員之一[2]，其胞外段經蛋白酶水解形成可溶型TRAIL(sTRAIL)。它可通過激活腫瘤細胞表面高表達的死亡受體(DRs) 4 和 5，啟動Caspase信號途徑，選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡[3]。而對多數(shù)正常細胞則表現(xiàn)出無毒或低毒性，具有良好的腫瘤細胞殺傷選擇性[4]。因此，TRAIL一經發(fā)現(xiàn)就被認為是極具潛力的抗癌藥物[5, 6]。

可溶型TRAIL的活性狀態(tài)為非共價連接的三聚體形式，穩(wěn)定性欠佳。并且，TRAIL作為小分子蛋白藥物，進入血液后可被腎小球的濾過作用快速清除[7]，造成其血漿半衰期極短(小鼠3-5 min，靈長類30-60 min)，生物利用度較低，嚴重限制了其體內抗腫瘤療效，這是導致其臨床試驗失敗的一個重要原因[8]。對TRAIL蛋白進行修飾改造以延長其血漿半衰期已成為近些年的研究熱點。如韋小越等[9]用PEG修飾可顯著延長TRAIL血漿半衰期并提高其穩(wěn)定性；羅嵐等[10]將抗體Fc結構域與TRAIL融合表達形成TRAIL-Fc融合蛋白，其體內半衰期得到大幅提升；Lim[11]等利用肝素和聚賴氨酸將TRAIL制成納米制劑可明顯改善其體內代謝。

脂質體(Liposome, LS)是一種常見的藥物載體，其制備簡單且經濟，具有良好的功能化和修飾潛力[12, 13]，小分子藥物經脂質體修飾遞送可有效改善體內代謝性質。納米級的脂質體還可通過增強滲透性和滯留(EPR)效應在腫瘤微環(huán)境中富集[14]。亦有相關文獻報道利用脂質體對TRAIL進行修飾改造。如范麗[15]采用薄膜水化法將TRAIL包裹于脂質體內部以改善其體內代謝，但TRAIL被脂質體包裹后可能限制其與死亡受體的結合，造成殺傷活性下降；Seifert等[16]利用雙官能團的PEG將TRAIL共價連接到脂質體表面，有效延長了其血漿半衰期，但此方法工藝相對復雜；Miguel等[17]將DOGS-NTA-Ni脂材摻入脂質體得到鎳螯合脂質體(LS-Ni)，再將帶6His標簽的TRAIL與LS-Ni進行混合孵育，可使其親和吸附于脂質體表面。此方法工藝簡單穩(wěn)定，是一種理想的TRAIL修飾遞送策略。他們對此方法制備的脂質體TRAIL進行體內外抗腫瘤活性研究，但并未探討此修飾方法對TRAIL穩(wěn)定性及血漿半衰期的影響。本研究，采用乙醇注入法制備鎳螯合脂質體，再將其與TRAIL孵育得到TRAIL脂質體(LS-Ni-T)，重點研究了鎳螯合脂質體修飾TRAIL后，對TRAIL蛋白體外穩(wěn)定性及體內血漿半衰期的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRAIL的制備參照先前的方法[18]。Cell Counting Kit-8(CCK8) 試劑盒購自美國MedChem Express (MCE)公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Thermo Fisher Scientific(GIBCO)公司；氫化大豆卵磷脂(HSPC)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)購自西安瑞禧公司；膽固醇(CHOL)購自Sigma公司；1,2-二油?；?甘油-3[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)-亞氨基二乙酸)琥珀?；鵠(DOGS-NTA-Ni)購自美國Avanti Polar Lipids公司；聚碳酸酯膜購自Whatman公司。ZETASIZER 分析儀是由英國Malvern公司制造；脂質體擠出器LF-1由美國Avanti公司制造；XP6百萬分之一超微量天平為德國梅特勒-托利多公司制造；Synergy H1酶標儀為美國BioTek公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 鎳螯合脂質體(LS-Ni)以及空白脂質體(LS)的制備。鎳螯合脂質體所使用的脂材及比例如下：HSPC：CHOL：DSPE-mPEG2000：DOGS-NTA-Ni=8：1：0.5：0.5，W/W。按照以上比例分別精確稱取各組分于1.5 mL EP管，加入適量的無水乙醇，65 ℃水浴條件下使脂材全部溶解，渦旋均勻形成油相；取3 mL PBS(pH 7.4)于5 mL離心管中，65 ℃水浴預熱，磁力攪拌使PBS形成漩渦，即為水相。用注射器將油相快速注入預熱的水相中，在65 ℃下溫和攪拌孵育30 min，形成脂質體，濃度為10 mg/mL。將脂質體轉入孔徑為100 kua的透析袋中，用PBS(pH 7.4)透析兩次，每次三個小時，完全除去乙醇。再將其裝入脂質體擠出器，依次通過孔徑為200 nm及100 nm的聚碳酸酯膜，分別擠出21次，獲得粒徑均一的鎳螯合脂質體(LS-Ni)。普通脂質體(LS)制備時不加入DOGS-NTA-Ni，其制備方法及比例與上述方法相同。

1.2.2 LS-Ni-T的制備。取適量PBS(pH 7.4)透析后的TRAIL蛋白與LS-Ni在室溫孵育30 min(TRAIL：DOGS-NTA-Ni=2：1，W/W)，期間用移液器溫和混勻三至四次，形成LS-Ni-T溶液。LS/T的制備按照上述投料量將TRAIL與LS混合得到。

1.2.3 LS-Ni-T的表征。將新制備的TRAIL / LS-Ni / LS-Ni-T以及不同儲存時間的LS-Ni-T，用PBS按照體積比為1∶100的比例稀釋，采用英國Malvern公司的ZETASIZER分析儀測定粒徑和Zeta電位，每份樣品重復3次。

1.2.4 SDS-PAGE檢測LS-Ni對TRAIL的親和吸附效果。通過高速離心檢測鎳螯合脂質體親和吸附TRAIL的效果。取30 μL LS-Ni-T，21000 g離心10 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀用15 μL電泳上樣緩沖液重懸。用不含DOGS-NTA-Ni的普通脂質體與TRAIL混合所得的LS/T作為對照組。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對它們進行電泳檢測。

1.2.5 細胞培養(yǎng)。人表皮鱗狀癌細胞株(A431)、人非小細胞肺癌細胞株(A549)、人源胚胎腎細胞(293T)用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基，人結腸癌細胞株(Colo205)用RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2(相對濕度90%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3 d更換一次培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，生長至80%-90%密度時傳代或鋪板，進行后續(xù)細胞實驗。

1.2.6 細胞毒性分析。采用CCK8試劑盒檢測LS-Ni-T對腫瘤細胞及正常細胞的殺傷作用。收集對數(shù)生長期的細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。丟棄舊的培養(yǎng)基，分別加入培養(yǎng)基稀釋的藥物(TRAIL或LS-Ni-T，每孔100 μL)，每個樣品平行三個復孔，空白對照組僅給予培養(yǎng)基。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK8試劑， 繼續(xù)培養(yǎng)1-4 h，至部分樣品孔呈現(xiàn)暗黃色。用SYNERGY H1酶標儀在450 nm處讀取吸光光度值(OD)。計算相對細胞存活率x(%)=[(OD給藥組-OD空白組)/(OD未給藥組-OD空白組)]×100%。

1.2.7 LS-Ni-T穩(wěn)定性考察。將LS-Ni-T和TRAIL分別用PBS稀釋至100 nM，生理條件(37 ℃)下孵育一定時間(0、4、12、24和48 h)，用含10% FBS的培養(yǎng)基再將蛋白稀釋至10 nM，加入提前接好Colo205細胞的96孔培養(yǎng)板中，37 ℃孵育24 h，用CCK8試劑盒檢測細胞存活率。將制備好的LS-Ni-T和TRAIL分別置于無菌1.5 mL EP管中，密閉，于儲存條件(4 ℃)分別放置0、5、10、15和20 d，測定儲存后TRAIL/LS-Ni-T的殺傷活性，并與初始值比較，評價穩(wěn)定性。

1.2.8 藥代動力學分析。通過檢測給藥后血漿對Colo205細胞的殺傷活性隨時間的變化趨勢，評估鎳螯合脂質體親和吸附TRAIL后，對TRAIL蛋白的血漿半衰期的影響。將6周齡的昆明小鼠分為三組(每組3只)，尾靜脈分別注射TRAIL、LS-Ni-T和LS/T(各組TRAIL換算劑量均為3 mg/kg)，分別在藥物注射10 min、0.5、1、2、4和8 h后，通過眼球取血，用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝，4000 g離心4 min，得到小鼠血漿。將血漿稀釋10、25、50、100和250倍，測試其對Colo205細胞的殺傷活性，來反映TRAIL、LS-Ni-T及LS/T在血漿中的存留情況。

1.2.9 統(tǒng)計學處理。實驗所得數(shù)據(jù)均以平均值(Mean ± SD)表示，各組數(shù)據(jù)差異性比較采用t-test(非參數(shù)檢驗)方法進行分析。結果用平均數(shù)的平均值±標準誤差(SEM)表示。

2 結果與討論

2.1 LS-Ni-T的制備

如“1.2.1 鎳螯合脂質體(LS-Ni)以及空白脂質體(LS)的制備”所述，制備鎳螯合及空白脂質體。LS-Ni與TRAIL室溫孵育30 min，得到鎳螯合脂質體修飾的TRAIL，即LS-Ni-T，結構如圖1(a)所示。其制備過程如圖1(b)所示。

圖1 TRAIL脂質體的結構與構建示意圖

2.2 LS-Ni-T的表征

注：TRAIL、LS-Ni和LS-Ni-T與PBS溶液按照1∶100的比例稀釋，用ZETASIZER Nano Series進行檢測。圖2 TRAIL、LS-Ni、LS-Ni-T的粒徑檢測

圖2為TRAIL蛋白的粒徑分布圖。由檢測結果可知，TRAIL蛋白的平均粒徑為8.15 ± 0.25 nm，LS-Ni的平均粒徑為119.23 ± 0.73 nm，LS-Ni-T的平均粒徑為127.33 ± 0.87 nm。相關數(shù)據(jù)見表1，LS-Ni-T粒徑相比LS-Ni增大約8 nm，提示TRAIL通過鎳螯合劑親和吸附在脂質體表面，從而使其粒徑增加。TRAIL、LS-Ni以及LS-Ni-T的多分散指數(shù)(PDI)均小于0.2，表明TRAIL、LS-Ni以及LS-Ni-T是高度均勻分布的，其Zeta電位分別為-5.34 ± 0.659 mV、-1.20 ± 0.130 mV、-6.95 ± 0.870 mV。

表1 TRAIL, LS-Ni 和 LS-Ni-T的表征分析

2.3 LS-Ni-T中TRAIL的親和吸附效果

注：泳道1:LS-Ni-T離心上清液；泳道2:LS-Ni-T離心沉淀；泳道3:未離心LS-Ni-T；泳道4:LS/T離心上清液；泳道5:LS/T離心沉淀；泳道6:未離心LS/T。圖3 SDS-PAGE檢測LS-Ni親和吸附TRAIL的效率

高速離心可將部分脂質體沉降，而TRAIL作為小分子蛋白在同等離心力下不能沉降，但當它與LS-Ni親和后，則在理論上可被離心沉降下來。據(jù)此來檢測LS-Ni-T中TRAIL被脂質體親和吸附效果。如圖3所示，高速離心后，LS-Ni-T離心上清(泳道1)中TRAIL蛋白量明顯比LS/T上清(泳道4)中的少；而LS-Ni-T離心沉淀(泳道2)中TRAIL蛋白量顯著多于LS/T沉淀中(泳道5)TRAIL的量。這表明在LS-Ni-T中，TRAIL可高效親和吸附在脂質體上，而被大量離心沉淀下來。

2.4 殺傷活性分析

選用腫瘤細胞Colo205、A549、A431和正常細胞293T，研究TRAIL經鎳螯合脂質體修飾后殺傷活性的變化。將TRAIL及LS-Ni-T用完全培養(yǎng)基稀釋不同倍數(shù)，分別加入Colo205、A549、A431及293T細胞中，通過細胞存活率來反應鎳螯合脂質體修飾對TRAIL殺傷活性的影響，結果見圖4。由圖4可見，腫瘤細胞存活率隨著藥物濃度的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。LS-Ni-T與TRAIL的細胞殺傷曲線幾乎重合，二者對這三種腫瘤細胞的殺傷活性無顯著差異(圖4 (a,b,c))。正常細胞293T，LS-Ni-T與TRAIL在0-100 nM濃度范圍均不產生明顯的殺傷作用，二者的殺傷曲線同樣高度重合(圖4(d))。這些結果表明，鎳螯合脂質體修飾TRAIL不影響其對腫瘤細胞的殺傷活性及對正常細胞的毒性。

注：(a) TRAIL和LS-Ni-T對Colo205細胞的殺傷曲線；(b) TRAIL/LS-Ni-T對A549細胞的殺傷曲線；(b) TRAIL/LS-Ni-T對A431細胞的殺傷曲線；(d) TRAIL/LS-Ni-T對293T細胞的殺傷曲線。圖4 殺傷活性分析

2.5 LS-Ni-T穩(wěn)定性分析

將LS-Ni-T于4 ℃儲存放置，在0、5、10、15和20 d分別取樣，用粒度儀測定其平均粒徑，多分散指數(shù)和Zeta電位。如表2所示，其平均粒徑和Zeta電位各時間內變化不大，無統(tǒng)計學差異，但儲存后的多分散指數(shù)(PDI)相比于第0 d有一定的增長。由此可知LS-Ni-T在4 ℃儲存條件下平均粒徑與表面Zeta電位保持穩(wěn)定，但粒徑均一性有所下降。

表2 LS-Ni-T在4 ℃ 儲存后的表征分析

作為多聚體蛋白，TRAIL穩(wěn)定性欠佳，其殺傷活性在溶液中會逐漸下降。本研究中進一步測試了鎳螯合脂質體修飾對TRAIL穩(wěn)定性的影響。將LS-Ni-T和TRAIL在生理條件(37 ℃)孵育0、4、12、24和48 h，或在4 ℃儲存0、5、10、15和20 d，分別檢測其對Colo205細胞的殺傷活性，以此來反映二者的穩(wěn)定性。如圖5 (a)所示，在37 ℃條件下，TRAIL蛋白的殺傷活性隨孵育時間的延長快速下降，孵育48 h后，1 nM濃度下其對Colo205細胞的殺傷效率不足20%，而LS-Ni-T的殺傷活性幾乎沒有變化。如圖5(b)和5(c)所示，TRAIL在4 ℃條件下儲存，殺傷活性逐漸下降，其在放置10、15和20 d后的殺傷活性較新制備的TRAIL顯著降低，而LS-Ni-T在4 ℃儲存5、10、15和20 d后，其殺傷活性與新制備的LS-Ni-T無顯著性差異。以上結果表明，無論是在37 ℃孵育還是在4 ℃儲存，游離的TRAIL蛋白穩(wěn)定性不佳，但鎳螯合脂質體親和吸附TRAIL后，會對其活性產生保護作用，增強其穩(wěn)定性。

注：(a) TRAIL和LS-Ni-T在37℃孵育0、4、12、24和48 h，檢測它們對Colo205的殺傷活性；(b) TRAIL在4 ℃儲存0、5、10、15和20 d，檢測其殺傷活性；(c) LS-Ni-T在4 ℃儲存0、5、10、15和20 d，檢測其殺傷活性。圖5 LS-Ni-T穩(wěn)定性分析

注：(a) 游離TRAIL的體內半衰期；(b) LS/T的體內半衰期；(c) LS-Ni-T的體內半衰期。圖6 藥代動力學實驗

2.6 藥代動力學實驗

鎳螯合脂質體親和吸附TRAIL后，理論上可避免其在血漿中被腎小球的濾過作用快速清除，從而延長TRAIL蛋白的血漿半衰期，在本研究中對此進行了驗證。將6周齡的昆明小鼠分為三組，每組三只，分別尾靜脈注射3 mg/kg的TRAIL、 LS/T和 LS-Ni-T，在0.25、0.5、1、2、4和8 h眼球取血，EDTA-2Na抗凝，離心得小鼠血漿。將血漿稀釋不同倍數(shù)，用Colo205細胞檢測其殺傷活性并繪制活性變化曲線，以此來反映TRAIL、LS/T和 LS-Ni-T在血漿中的代謝情況。如圖6所示，TRAIL和LS/T組體內代謝1 h后，其血漿稀釋50倍已檢測不出對細胞的殺傷作用(圖6 (a)、(b))，而LS-Ni-T組代謝8 h后的血漿稀釋50倍仍能殺傷近一半的細胞(圖6(c))。進一步比較各組血漿稀釋10、25、100和250倍的殺傷曲線，LS/T組相比TRAIL組殺傷活性無顯著性差異，而LS-Ni-T組活性下降明顯比TRAIL及LS/T組延緩。以上數(shù)據(jù)表明，鎳螯合脂質體親和吸附TRAIL形成LS-Ni-T后，可顯著延長TRAIL的體內血漿半衰期。

3 結論

鎳螯合脂質體修飾是一種簡單有效的TRAIL遞送策略。本研究，利用DOGS-NTA-Ni脂材制備了含鎳螯合劑的脂質體LS-Ni，再將其與含6His標簽的TRAIL進行孵育，使TRAIL親和吸附到脂質體表面，得到LS-Ni-T。研究結果表明，TRAIL可有效吸附到LS-Ni上，其修飾并不改變TRAIL對腫瘤細胞的殺傷活性，但可顯著提高TRAIL在4 ℃儲存條件和37 ℃生理條件下的穩(wěn)定性。更為重要的是，本研究證實鎳螯合脂質體修飾可顯著延長TRAIL的體內半衰期，將為后續(xù)這類藥物的開發(fā)提供有價值的參考。