郭 雙，蔡小利，胡宗福，?；?，馬德慧，王 梓，付麗云，陳志強*，劉 鍇*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，通遼 028000； 2.內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，赤峰 024000)

家禽腸道中棲息著復(fù)雜而又處于動態(tài)平衡的腸道菌群，這些腸道菌群與宿主相互作用，對宿主健康與代謝有著重要的影響。腸道菌群代謝可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸、氨基酸、維生素及酶類，為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)[1-3]。腸道菌群還能通過競爭性排斥來抵抗病原微生物的侵襲，提高動物對腸道病原微生物的抵抗力[4]。

雞腸道菌群具有多樣性，Wei等[5]通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，雞腸道菌群可歸屬為13個門，117個屬，以擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicute)及變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌群。雞不同腸道區(qū)段的菌群有所差異，對18日齡肉仔雞嗉囊、回腸和盲腸微生物菌群的研究表明，厚壁菌門豐度達60%，其次是擬桿菌門，在嗉囊和小腸中乳桿菌屬(Lactobacillus)是優(yōu)勢菌屬[6]。十二指腸和空腸因pH較低，菌群多樣性也最低，有研究發(fā)現(xiàn)，十二指腸和空腸的乳桿菌屬豐度達到了99%[7]。也有研究報道了中藥對雞及其他動物腸道菌群的影響，于佳楠等[8]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥能夠降低變形菌門的豐度，并在屬水平上顯著降低瘤胃球菌屬(Ruminococcus)豐度，提高考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)豐度。李琳倩等[9]發(fā)現(xiàn)，中草藥提高了后備母豬糞樣中糞球菌屬2(Coprococcus2)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)等的豐度，調(diào)節(jié)了動物腸道菌群。

本研究以健康白來航雛雞為研究對象，通過一株致病性大腸桿菌引起雛雞腹瀉，選用赤芍黃柏中藥制劑來進行治療，觀察其對雛雞腸道菌群的影響，探尋腸道菌群變化在雞腹瀉性疾病中的作用，以期為生產(chǎn)及相關(guān)理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為15日齡健康白來航雛雞，由通遼某孵化場提供。赤芍黃柏中藥制劑由華天制藥提供，每毫升含生藥1 g，具體配方：赤芍與黃柏比例為4∶5(93 g∶117 g)，制法為以上兩味藥加8倍量水煎煮3次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至1 mL相當(dāng)于1 g原藥材，即得。致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)菌種由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室微生物實驗室在雞體內(nèi)分離并冷凍保存。

1.2 主要儀器與試劑

超凈臺、漩渦振蕩器、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、顯微鏡、高壓滅菌鍋。所用培養(yǎng)基主要有普通固體培養(yǎng)基及普通液體培養(yǎng)基。

1.3 雛雞處理與飼養(yǎng)

1.3.1 試驗設(shè)計 本試驗選用240只15日齡健康白來航雛雞，隨機分為對照組(CON)、感染組(BC)、低劑量治療組(TL)及高劑量治療組(TH)，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20只雛雞。BC組、TL組及TH組的雛雞按照半數(shù)致死量(8.6×105CFU·只-1)腹腔注射致病性大腸桿菌，CON組注射等量的滅菌生理鹽水。TL組及TH組在感染后0.5 d使用赤芍黃柏制劑治療，制劑按不同的劑量與滅菌水充分混勻，每日兩次飲水，CON組及BC組正常飲用滅菌水，所有試驗組飼料均不進行處理，連續(xù)治療5 d。感染1 d后，每天記錄發(fā)病數(shù)與死亡數(shù)。

1.3.2 飼養(yǎng)管理 雛雞在室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在35 ℃左右，隨著雛雞日齡增長適當(dāng)降低溫度。飼養(yǎng)雛雞前1周先對飼養(yǎng)環(huán)境使用0.5%的新潔爾滅進行消毒，包括地面、墻壁、飲水器、飼喂器等。每日定時更換雞籠下墊的報紙，并使用0.5%的新潔爾滅對雞籠進行消毒。每日觀察雛雞的精神狀態(tài)，做好記錄并保存死亡雛雞。

1.3.3 中藥飲水的制備 中藥制劑為赤芍與黃柏混合物，由華天制藥提供。TL組赤芍黃柏制劑與滅菌水濃度配比為4 mL·L-1，TH組赤芍黃柏制劑與滅菌水濃度配比為12 mL·L-1，CON組與BC組雛雞均飲用滅菌水。

1.4 樣本采集與處理

試驗結(jié)束后，每個重復(fù)隨機選取3～4只雛雞放血處死，隨后無菌狀態(tài)下解剖留取十二指腸內(nèi)容物及黏膜裝于1.5 mL離心管，-80 ℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 腸道菌群多樣性的測定

取存于-80 ℃的腸道內(nèi)容物與黏膜混合樣品約0.5 g，按照MP-bio土壤DNA提取試劑盒說明書進行細菌基因組的提取。首先，針對16S rRNA基因的V3～V4區(qū)設(shè)計引物(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，引物兩端帶有12 bp的barcode，用以識別不同樣品的序列。然后進行PCR擴增，程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，之后進入擴增循環(huán)，循環(huán)過程為95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為35，最后是72 ℃延伸10 min。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences，CA，USA) 進行純化。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina，San Diego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和檢測合格后，基于Illumina Miseq PE300平臺進行高通量測序(上海美吉生物工程有限責(zé)任公司)。

1.6 腸道菌群分析

對原始序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，主要包括去除尾部質(zhì)量值低于20(即堿基錯誤率低于1%)的序列，去除低于50 bp及含N堿基的序列。根據(jù)雙端序列之間的重疊關(guān)系，使用FLASH軟件進行拼接、所得序列使用QIIME進行分類學(xué)鑒定和α多樣性分析(Shannon、Simpson、Sobs、Ace、Chao)。使用Uparse(vsesion 7.1 http://drive5.com/uparse/)平臺，基于97%相似性水平上對所得序列進行OTU聚類分析，并采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)分析，序列對比數(shù)據(jù)庫Silva(Release132 http://www.arb-silva.de)。

1.7 統(tǒng)計分析

使用R語言進行物種組成、主成分(PCA)統(tǒng)計分析和作圖。采用R語言pheatmap包對染毒組及其處理組雛雞腸道菌群進行環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析。所得數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS19.0軟件，對雛雞發(fā)病率及死亡率采用ANOVA檢驗不同組間差異性，對所得菌群序列數(shù)據(jù)及其多樣性采用Kruskal-Wallis H test檢驗進行樣本間的顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 赤芍黃柏制劑對致病性大腸桿菌感染雛雞的治療效果

發(fā)病雛雞表現(xiàn)為精神委頓、耳耷頭低、不思飲水、拉稀便、眼半閉、不鳴叫、反應(yīng)遲鈍、縮頸。剖檢后發(fā)現(xiàn)肝組織淤血，表面有部分壞死；脾腫大出血；部分雛雞心表面有纖維素性滲出，呈心包炎癥狀；氣囊混濁，腎腫大充血，腸系膜出血，腹腔內(nèi)有淡黃色積液，伴有臭味。治療5 d后，BC組和TL組發(fā)病率和死亡率都顯著高于CON組，TH組的發(fā)病率和死亡率顯著高于CON組但低于BC組和TL組(P<0.05，表1)。

表1 赤芍黃柏制劑對致病性大腸桿菌感染雛雞的治療效果

2.2 赤芍黃柏制劑對致病性大腸桿菌感染的雛雞腸道菌群α多樣性分析

對樣本的原始測序數(shù)據(jù)進行系列質(zhì)控后得到有效序列數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示共獲得 671 993 個有效序列，平均序列長度428 bp。4組腸道菌群共獲得28個門、50個綱、106個目、167個科、287個屬、375個種及474個OTUs。優(yōu)化序列和OTU數(shù)量在各組間無顯著差異(P>0.05，表2)。

表2 腸道菌群有效序列及OTU數(shù)量分析

對各組腸道菌群序列抽平至序列數(shù)位29 568后，進行α多樣性分析，分析指標(biāo)包括物種多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)和物種豐富度指數(shù)(Sobs、Ace、Chao)。結(jié)果顯示，Sobs指數(shù)和Ace指數(shù)在TL和TH組顯著高于CON組，CON組的Simpson指數(shù)顯著高于其他各組，而Chao指數(shù)顯著低于其他各組(P<0.05，表3)。稀釋曲線(Rarefaction curve)及香農(nóng)-威爾曲線(Shannon-Wiener)均趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，能夠反映樣品中主要的菌群多樣性信息(圖1)。由Sobs、Chao指數(shù)可見，添加赤芍黃柏制劑顯著增加了物種豐富程度(P<0.05)。

2.3 赤芍黃柏制劑對致病性大腸桿菌感染的雛雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

主成分分析顯示(圖2)，雞腸道樣品聚類明顯，所有樣品可以聚類為3個類群：CON組的樣品單獨聚類，TH組樣品單獨聚類，BC及TL 的樣本聚類在一起。Adonis 分析顯示，組間差異顯著(R2=0.52,P=0.005)。

表3 腸道菌群α多樣性指數(shù)分析

圖1 腸道樣本稀釋曲線(A)及香農(nóng)指數(shù)曲線(B)Fig.1 Rarefaction curves (A) and Shannon curves (B) of gut bacterial community

圖2 不同處理對雛雞腸道菌群影響的主成分分析(PCA)Fig.2 Principal component analysis (PCA) showed the difference of gut bacterial community between groups

2.4 基于各分類水平下雛雞腸道菌群的變化

厚壁菌門在各組占絕對優(yōu)勢，其豐度在CON組為96.96%、在BC組為62.57%、在TL組為97.41%、TH組為94.94%。變形菌門(Proteobacteria)在某些處理組中也占有一定的豐度，CON為2.89%，BC為37.39%，TL為2.30%，TH為2.13%。此外，TH組尚有ε-變形菌綱豐度為1.91%(圖3)。

圖3 門分類水平的雛雞腸道菌群變化Fig.3 The intestinal bacterial community of chick at the phylum level

在目水平上，各組雛雞腸道菌群豐度差別較大。CON組優(yōu)勢菌群為乳桿菌目(Lactobacillales)，豐度為96.03%，其他豐度大于1%的菌屬為腸桿菌目(Enterobacteriales)(2.67%)。BC組優(yōu)勢菌群有3個 菌目，即乳桿菌目(42.77%)、芽孢桿菌目(Bacillales)(19.79%)、腸桿菌目(34.41%)。其他豐度大于1%的尚有：假單胞菌目(Pseudomonadales)(2.96%)。TL組優(yōu)勢菌群有乳桿菌目(68.12%)和芽孢桿菌目(29.03%)。其他豐度大于1%的有腸桿菌目(1.44%)。TH組優(yōu)勢菌群為乳桿菌目(90.93%)，豐度在1%以上菌屬為芽孢桿菌目(3.11%)、彎曲菌目(Campylobacterales)(1.91%)、β-變形菌目(Betaproteobacteriales)(1.46%)(圖4)。

圖4 目分類水平的雛雞腸道菌群變化Fig.4 The intestinal bacterial community of chick at the order level

在屬水平上空白對照組和試驗組腸道菌群豐度差別較大(圖5)。CON組優(yōu)勢菌群為腸球菌屬(Enterococcus)，豐度為83.92%，其他豐度大于1%的菌屬分別為乳球菌屬(Lactobacillus)(3.70%)、片球菌屬(Pediococcus)(4.49%)、大腸桿菌屬(Escherichia)(1.58%)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)(1.09%)。BC組優(yōu)勢菌群有3個菌屬，即腸球菌屬(40.12%)、葡萄球菌屬(19.79%)及大腸桿菌志賀氏菌屬(33.03%)。其他豐度大于1%的尚有: 假單胞菌屬(Pseudomonas)(2.96%)、魏斯氏菌屬(Weissella)(1.45%)、克雷伯氏菌屬(1.38%)。TL組優(yōu)勢菌群也有3個菌屬，即腸球菌屬(36.11%)、葡萄球菌屬(29.01%)、及乳桿菌屬(20.80%)。其他豐度大于1%的尚有片球菌屬(4.49%)、魏斯氏菌屬(6.29%)大腸桿菌屬(1.42%)。TH組優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌(Lactobacillus)(87.09%)，豐度在1%以上菌屬為葡萄球菌屬(3.08%)，片球菌屬(2.71%)、螺桿菌屬(Helicobacter) (1.88%)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)(1.28%)。

差異顯著性分析顯示，腸球菌屬在CON組顯著高于其他各組，在BC組顯著高于TH組(P<0.05)。 乳桿菌屬在TH組顯著高于其他各組，葡萄球菌屬在TL組顯著高于其他各組，埃希氏菌屬在BC組顯著高于其他各組(P<0.05，表4)。

圖5 屬水平上雛雞腸道菌群Fig.5 The intestinal bacterial community of chick at genus level

2.5 雛雞腸道菌群的環(huán)境因子分析

相關(guān)性heatmap圖通過相關(guān)性數(shù)值能夠可視化展示樣本中不同物種與環(huán)境變量之間的關(guān)系，評估微生物分類與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。通過對感染雛雞腸道菌群與其發(fā)病率和死亡率的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示，大腸桿菌屬及腸球菌屬與發(fā)病率和死亡率成正相關(guān)，而乳桿菌屬與發(fā)病率和死亡率成負(fù)相關(guān)(P<0.05)。葡萄球菌屬與發(fā)病率成正相關(guān)(P<0.05，圖6)。

表4 屬水平上雛雞各組樣本主要腸道菌群的相對豐度

圖6 熱圖分析環(huán)境因子與腸道菌群物種之間相關(guān)性Fig.6 Relationship of gut bacterial community with environmental factors analyzed by thermography

3 討 論

中藥制劑在我國有著悠久的歷史，中藥制劑具有很多優(yōu)勢，因其副作用較小、治本作用較好、價格便宜、臨床療效確切而被廣泛應(yīng)用于臨床[10]。研究發(fā)現(xiàn)，赤芍具有免疫活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性和抗炎作用等[11]。赤芍化學(xué)成分和藥理作用較為明確，在臨床上多與黃柏配伍使用。在臨床方面，黃柏具有降血糖、降血壓、免疫抑制等多種藥理作用[12]。因中草藥不易產(chǎn)生耐藥性，并且能調(diào)節(jié)機體免疫力等優(yōu)點使其在家禽疾病預(yù)防的應(yīng)用中更具價值[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，赤芍黃柏制劑對雛雞感染致病性大腸桿菌的治療及預(yù)防具有很好的效果，并且高劑量治療組比低劑量治療組效果好。因此，本試驗條件下，建議以劑量為12 mL·L-1的飲水(1 g·mL-1生藥)治療雛雞大腸桿菌性腹瀉。

在健康的腸道中存在著多種微生物，它們與機體之間相互作用，保持著動態(tài)平衡，如果這種平衡被打破，機體便可能會患腸道疾病。穩(wěn)定的腸道菌群與人體能量的攝取、代謝以及免疫系統(tǒng)疾病有關(guān)[14]。由于雞十二指腸pH低，腸道菌群比較單一，因此，對這一腸段的腸道菌群進行考察可以更為顯著地發(fā)現(xiàn)不同處理對雛雞腸道菌群的影響。

本研究顯示，在門水平上，雛雞十二指腸以厚壁菌門為主，感染后增加了變形菌門的豐度，降低了厚壁菌門的豐度。其他對于盲腸和回腸的研究顯示了與本試驗不同的結(jié)果。羅雯等[15]研究顯示，寧都黃雞盲腸菌群以擬桿菌門豐度最大，厚壁菌門次之；梁小瑞等[16]研究顯示，肉雞盲腸厚壁菌門為優(yōu)勢菌群；而Han等[6]研究顯示，回腸以厚壁菌門為優(yōu)勢菌門。這些研究表明，不同雞品種、不同腸段以及不同飲食條件下雞腸道菌群是存在著一定差異的。

本試驗結(jié)果顯示，在屬水平上，對照組雛雞十二指腸腸道菌群以腸球菌屬為主。腸球菌屬是動物腸道正常的菌群，大部分不引起動物疾病，如糞腸球菌對大腸桿菌、腸炎耶爾森菌和普通變形桿菌致病菌具有抑菌作用，被認(rèn)為是可以提高畜禽抗病力和生產(chǎn)性能的益生菌[17-18]。與本研究有所差異的是，Ewers等[19]研究顯示，肉雞盲腸擬桿菌屬豐度最大，其次是糞桿菌屬。

本研究顯示，大腸桿菌的感染顯著增加了雞腸道菌群中大腸桿菌屬及葡萄球菌屬的豐度，降低了腸球菌屬豐度。大腸桿菌屬的一些種類是重要的致病菌，如致病性大腸桿菌常引起動物腹瀉，在世界范圍內(nèi)引起了人類及動物極大的發(fā)病率和死亡率[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，對肉雞腹腔注射志賀菌后，免疫組化和電鏡結(jié)果顯示，志賀菌可以侵入腸道上皮，引起雞腸道病理學(xué)變化[22]。由此推測，本試驗中感染組腸道中志賀菌豐度的增長可能來源于注射的菌株入侵腸道后增殖所致。而梁小瑞等[19]也使用大腸桿菌注射感染肉仔雞，顯示感染后肉仔雞盲腸腸道菌群發(fā)生了輕微的變化，如擬桿菌屬豐度有所降低，糞桿菌屬及乳桿菌屬豐度有所升高。與本試驗結(jié)果的差異可能是由于腸道部位的不同及感染菌株的不同所致。本研究顯示，葡萄球菌屬豐度在感染組顯著高于對照組。葡萄球菌屬中的金黃色葡萄球菌是一種條件性致病菌，可在人類和動物中引起廣泛的疾病[23]。本研究對葡萄球菌屬和雞的發(fā)病率做的相關(guān)性分析也顯示了葡萄球菌屬與雞發(fā)病率成正相關(guān)。

乳桿菌屬為益生菌，具有良好的產(chǎn)有機酸性能，該屬在食品發(fā)酵或人類及動物健康方面有廣泛應(yīng)用，如鼠李糖乳桿菌用來提高人類或動物的免疫力及生長繁殖性能[24-25]，干酪乳桿菌不但可以用來制作酸奶，還能增強人類免疫力，促進急性腹瀉和關(guān)節(jié)炎的康復(fù)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，赤芍黃柏制劑可以降低雛雞腸道菌群多樣性，提高乳桿菌屬的豐度。乳桿菌屬在低劑量赤芍黃柏制劑處理后有一定量的增加，在高劑量赤芍黃柏制劑處理組則達到了最大值(87.09%)。本試驗結(jié)果顯示，高劑量組發(fā)病率和死亡率顯著降低，由相關(guān)性熱圖分析可見，乳桿菌屬與感染雛雞發(fā)病率和死亡率呈負(fù)相關(guān)，說明乳桿菌屬對大腸桿菌感染引起的腹瀉具有一定的治療作用。同時，腸球菌屬及葡萄球菌屬豐度隨著赤芍黃柏劑量的增加而降低。在屬水平上空白對照組和實驗組腸道菌群豐度差別較大。

腸道內(nèi)乳桿菌屬及糞腸球菌均為益生菌。本研究發(fā)現(xiàn)，赤芍黃柏制劑極大地促進了乳桿菌屬的增長，由空白對照組3.7%的豐度增加到高劑量組的87.09%，豐度增加了23.54倍。本研究使用環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬的發(fā)病率及死亡率呈負(fù)相關(guān)，表明它能夠抑制大腸桿菌的增長，促進腸道菌群的平衡，對疾病的預(yù)防及治療具有一定的效果。本研究顯示，腸球菌屬與發(fā)病率和死亡率在處理組之間呈正相關(guān)，這可能是由于處理組乳桿菌屬豐度的增加引起的一種被動關(guān)系，因為對照組中腸球菌屬豐度也很高，但其發(fā)病率和死亡率很低。腸球菌屬是健康動物腸道中主要的常存菌群，包括的種類和作用復(fù)雜，既有益生菌，又有條件性致病菌，其在動物腸道菌群中的作用尚需深入研究[28]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，飲水中添加赤芍黃柏中藥制劑可治療致病性大腸桿菌引起的腸道疾病，使大腸桿菌感染的雛雞發(fā)病率及死亡率降低。大腸桿菌感染及赤芍黃柏制劑治療均可改變雛雞腸道菌群豐富度及多樣性。大腸桿菌感染使十二指腸腸道大腸桿菌屬及葡萄球菌屬豐度增加，赤芍黃柏中藥制劑的使用可使乳桿菌屬豐富度增加。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性分析認(rèn)為，乳桿菌屬在提高雛雞抗病力方面起到正相關(guān)的作用，而大腸桿菌屬的增加會提高雛雞發(fā)病率和死亡率。綜合認(rèn)為，飲水中添加赤芍黃柏制劑可使雛雞腸道內(nèi)物種多樣性和豐富度降低，益生菌豐度增加，有害菌受到抑制，從而改善胃腸道疾病。研究結(jié)果將對生產(chǎn)和科學(xué)研究提供有價值的參考。