賀尚文，王月明，張 慧，侯思魯，劉曉曄，董 虹*

(1.北京農(nóng)學院 獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2. 北京大學，北京 100871)

白頭翁湯是《傷寒論》清熱解毒類方劑中的代表方劑，具有涼血止痢之效[1]。目前研究表明，白頭翁湯具有較好的抗菌抗炎作用[2-3]，可通過降低IL-8、ICAM-1水平調(diào)節(jié)腸道組織炎癥以治療大鼠大腸桿菌性腹瀉，并與抗生素治療相比可明顯保護腸道菌群的種類及豐度，在治療動物細菌性疾病方面具有較好的應用前景[4]。內(nèi)毒素(LPS)是由革蘭陰性菌產(chǎn)生的一種強致病性毒素，可引起機體強烈的炎癥反應，導致內(nèi)毒素血癥[5]，常被用作刺激因子調(diào)控IL-6、IL-1β等相關炎性因子的表達，構建炎癥模型[6-7]。LPS-TLR4的信號通路轉(zhuǎn)導途徑是目前常見的LPS刺激途徑，LPS主要通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)識別宿主細胞并激活天然免疫系統(tǒng)[8]。LPS與TLR4結(jié)合后TLR4產(chǎn)生構象變化激活下游信號通路，使得下游的腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6, TRAF6)活化，引起 ERK、JNK 和 p38 的 MAPK 信號轉(zhuǎn)導而導致炎性因子的釋放，引發(fā)病理變化[9]。實驗室前期研究表明，白頭翁湯具有良好的抗毒素藥理作用，可通過抑制炎癥反應，降低LPS誘導的大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞(rat microvascular endothelial cells, RIMVECs)損傷，保護微血管內(nèi)皮細胞，從而激活跨內(nèi)皮中性粒細胞(PMNs)溶菌酶，增強PMNs殺菌能力，發(fā)揮抗菌作用[10-13]。但其中具體作用機制尚不明確，因此本研究以RIMVECs細胞為模式細胞，利用RT-PCR、Western blot等方法檢測白頭翁湯對LPS誘導的RIMVECs 的TLR4、TRAF6、P-ERK基因及蛋白表達的影響；以ERK1/2信號通路特異性阻斷劑PD98059作用后探究對下游炎性因子的影響，從而研究白頭翁湯的抗炎機制，為抗炎中藥的開發(fā)奠定試驗基礎，為抗炎策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白頭翁(批號：801001104)、黃連(批號：18121402)、黃柏(批號：18052601)、秦皮(批號：180713001)購自北京同仁堂藥店，DMEM高糖培養(yǎng)基、D-Hank’s干粉、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶均購自GiBco公司，L-谷氨酰胺、二甲基亞砜、LPS、Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司，超純RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture (WithROX)、DNase1、5×RNA Loading Buffer購自北京康為世紀生物科技有限公司，TRAF-6、TLR4、Erk1+Erk2抗體購自Abcam公司，羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司，大鼠IL-6、IL-8、IL-β、TNF-α ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，PD98059購自MCE公司。

1.2 主要儀器

奧林巴斯倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號：IX71)，CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號：MCO-17AC)PCR儀(美國ABI公司，型號：2720)，實時熒光定量PCR系統(tǒng)(德國Roche公司，型號：LightCycler?480II)，垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-rad | Biorad，型號：PROTEAN Tetra+ Trans-Blot)，凝膠成像儀(上海天能，型號：Tanon-5200)，多功能酶標儀(美國Bio tek，型號：SYNERGY4)。

1.3 試驗材料

原代培養(yǎng)的1～3日齡SD大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞，經(jīng)純化、鑒定、可穩(wěn)定傳代后用于本試驗。稱取黃連15 g、黃柏10 g、秦皮20 g、白頭翁20 g按獸藥典[14]中方法制備白頭翁湯水煎液，然后濃縮生藥濃度至1 g·mL-1，0.22 μm濾膜過濾后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹13]。

1.4 細胞的分組與處理

將RIMVECs細胞分為空白對照組、LPS組和白頭翁湯組。待細胞長至80%～90%匯合狀態(tài)時，各組進行如下處理：對照組，加入維持培養(yǎng)基(2% DMEM)作用細胞28 h；LPS組，加入10 μg·mL-1的LPS作用于細胞4 h后使用2% DMEM作用24 h； 白頭翁湯組，LPS作用4 h后使用20 μg·mL-1白頭翁湯作用細胞24 h。涉及PD98059(ERK1/2抑制劑)處理的細胞分組中，PD98059組使用20 μmol·L-1PD98059預處理細胞2 h后加入10 μg·mL-1的LPS 作用細胞4 h，使用2% DMEM作用細胞24 h，其余各組在上述分組處理基礎上使用2% DMEM預處理細胞2 h。

1.5 RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄

使用總RNA提取試劑盒提取RIMVECs細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系共20 μL，加入1.2 μL Primer mix及總RNA 3 μg(6～7 μL)，70 ℃孵育5 min，立即冰浴5 min，隨后短暫離心將管壁上的溶液離心至管底。繼續(xù)向以上反應管中加入以下試劑：4 μL 5×RT Buffer，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，0.75 μL 10 mmol·L-1dNTP Each，0.2 μL HiFi-MMLV Enzyme Mix，加H2O 至20 μL。輕輕混勻,42 ℃孵育45 min，85 ℃保溫5 min。用熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。取Roche 384孔板，分別編號，按如下反應體系進行: 2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1) 0.5 μL，DNA模板 2 μL，加入滅菌蒸餾水至25 μL，程序為95 ℃預變性3 min，40個循環(huán)(95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s)。其中根據(jù)GenBank中TLR4、TRAF6基因序列，采用Primer Premier 5.0設計1對特異引物(表1)，由北京基譜生物科技有限公司合成。根據(jù)GenBank中MAPK3基因序列，采用Primer Premier 5.0設計1對 特異引物(表1)，由蘇州吉瑪基因有限公司合成。

表1 GAPDH、TLR4、TRAF6、ERK基因引物

1.6 Western blot

使用RIPA裂解緩沖液提取細胞的總蛋白并按照碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)BCA的結(jié)果將每組樣品使用裂解液統(tǒng)一至相同濃度后按4∶1的比例加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混合均勻后，于100 ℃條件下煮沸8 min, 使蛋白充分變性。按電泳時的上樣量合理分裝，-80 ℃ 保存。8% SDS-PAGE檢測TLR4、TRAF6、P-ERK，使用GAPDH校正，所有蛋白條帶灰度值均使用Image J軟件進行分析。

1.7 ELISA檢測細胞炎性因子

收集各組細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書要求使用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié) 果

2.1 白頭翁湯對LPS作用的RIMVECs中TLR4、TRAF6及ERK基因表達的影響

為了探究白頭翁湯是否通過TLR4-ERK1/2信號通路的級聯(lián)作用產(chǎn)生抗炎效應，檢測TLR4、TRAF6及ERKmRNA的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組TLR4、TRAF6的基因相對表達量顯著升高(P<0.01，P<0.001)，ERK的基因相對表達量有升高趨勢但無顯著變化(P>0.05)。與LPS刺激組相比，白頭翁湯組TLR4、TRAF6、ERK的基因相對表達量降低，差異顯著(P<0.001，P<0.001，P<0.01)，結(jié)果見圖1。

圖1 白頭翁湯對 LPS 作用的RIMVECs TLR4、TRAF6 及 ERK mRNA表達的影響Fig.1 Effect of Pulsatilla decoction on the relative expression of RIMVECs TLR4, TRAF6 and ERK genes induced by LPS

2.2 白頭翁湯對LPS作用的RIMVECs TLR4、TRAF6及P-ERK蛋白表達的影響

白頭翁湯能從基因的轉(zhuǎn)錄水平較好地抑制RIMVECsTLR4 及TRAF6、ERK的表達，為了進一步探究白頭翁湯能否抑制到蛋白表達，采用 Western blot 法從蛋白水平研究白頭翁湯的抗炎作用機制。圖2、3結(jié)果表明，LPS組和空白對照組相比TLR4、TRAF6、P-ERK的相對表達量升高，差異顯著(P<0.01，P<0.05，P<0.001)，白頭翁湯組和LPS組相比，TLR4、TRAF6、P-ERK的相對表達量降低，差異顯著(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

圖2 白頭翁湯對 LPS 作用的RIMVECs TLR4、TRAF6、P-ERK 蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Pulsatilla decoction on the expression of TLR4, TRAF6 and P-ERK protein in RIMVECs stimulated by LPS

A. TLR4 灰度值分析；B. TRAF6 灰度值分析；C. P-ERK 灰度值分析A. Gray value analysis of TLR4; B. Gray value analysis of TRAF6; C. Gray value analysis of P-ERK圖3 TLR4、TRAF6、P-ERK 相對表達量灰度值分析Fig.3 Gray value analysis of relative expression of TLR4, TRAF6 and P-ERK

2.3 白頭翁湯對LPS誘導的RIMVECs P-ERK表達的影響

由圖4、5可知，與空白對照組相比，LPS組P-ERK 水平顯著增高(P<0.01)，白頭翁湯組顯著降低了LPS所誘導的RIMVECs P-ERK水平(P<0.05)，與上述結(jié)果一致。抑制劑組與LPS組相比，P-ERK的蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，并且白頭翁湯組與抑制劑組相比作用效果無顯著差異。

圖4 P-ERK 蛋白表達情況Fig.4 Expression of P-ERK

圖5 P-ERK 相對表達量灰度值分析Fig.5 Gray value analysis of relative expression of P-ERK

2.4 白頭翁湯對LPS處理的RIMVECs IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達的影響

由圖6可知，與空白對照組相比，LPS作用后，RIMVECs 的IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達顯著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，而與LPS組相比，白頭翁湯組IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達顯著降低(P<0.05，P<0.001，P<0.05，P<0.05)。同時抑制劑組與LPS組相比其下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌顯著降低(P<0.05，P<0.001，P<0.05，P<0.01)。白頭翁湯組與抑制劑組相比其下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的分泌無顯著性差異。

3 討 論

微血管內(nèi)皮細胞(MVECs)是機體重要的保護屏障，其在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抗炎等方面都具有重要作用[15]。MVECs在細菌病的發(fā)生過程中有著十分重要的作用，是多種細菌毒素的靶標[16-17]。致病因子會首先識別MVECs膜上的特異性受體并與之結(jié)合來破壞MVECs的屏障作用[18]，進而引發(fā)炎癥反應[19]。其中，LPS是細菌所產(chǎn)生的重要毒力因子，在細菌性疾病發(fā)生過程中起重要作用，研究表明，其主要通過損傷MVECs發(fā)揮致病作用[20]。尤青海等[21]研究發(fā)現(xiàn)LPS可通過PI3K/Akt信號通路誘導RACK1及rac1表達造成大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷導致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫。在研究Apelin-13對LPS誘導大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞炎性因子表達的影響時發(fā)現(xiàn)，LPS還可通過干預 ROS-NF-κB 信號通路誘導炎性因子的表達并最終損害內(nèi)皮細胞功能[22]。在腦微血管內(nèi)皮細胞中，秦劭晨等[23]發(fā)現(xiàn)，LPS處理可升高腦微血管內(nèi)皮細胞 TNF-α、CCL20、IL-8 mRNA表達量，誘導炎性因子分泌增加最終導致腦小血管疾病。由此可見保護微血管內(nèi)皮細胞對于治療LPS所致的機體損傷具有重要意義。而研究發(fā)現(xiàn)中藥對 MVECs 具有多種調(diào)節(jié)作用，包括改變血管的通透性、促進細胞的增殖、減少炎癥的分泌等[24-25]。白頭翁湯主要成分為皂苷類：白頭翁皂苷A、B、B4；生物堿類：小檗堿及藥根堿；檸檬苦素類：黃柏內(nèi)酯；香豆素類：秦皮甲素、秦皮乙素及葡萄糖苷[4]。前期研究表明，其在抑制LPS所致的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷、治療腸道炎癥方面具有良好的效果。節(jié)陽華等[26]研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯可通過阻斷JAK2/STAT3通路的轉(zhuǎn)導，改善結(jié)直腸癌中炎性微環(huán)境從而達到抗腫瘤的效果。在潰瘍性結(jié)腸炎治療中，白頭翁湯可通過調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)如維持Th17/Treg的平衡、增加miR-19a的表達等，調(diào)節(jié)NF-κB mRNA的水平、黏附分子水平及影響TGF-β1/Smad3信號通路等途徑發(fā)揮顯著抗炎作用[27]。

因此，本試驗以RIMVECs細胞為材料，探究白頭翁湯是否通過抑制TLR4-ERK1/2信號通路而發(fā)揮抗炎作用。炎癥Toll樣受體(TLR)4屬于TLR受體家族，可誘導對入侵病原體的炎癥反應，是參與介導LPS誘導跨膜信號轉(zhuǎn)導和細胞激活的受體，廣泛分布于內(nèi)皮細胞等多種免疫細胞中，在機體免疫過程中具有重要作用[28]。TLR4激活后會引起一系列的下游蛋白的反應，包括引起TRAF6活化、ERK1/2的磷酸化等。ERK1/2是MAPK成員之一，許多文獻都表明 ERK1/2 在控制炎癥方面發(fā)揮重要作用，其持續(xù)的激活可引起炎癥細胞因子不斷產(chǎn)生，和其上游的 MAPKK 及 MAPKKK 共同作用，導致級聯(lián)“瀑布”效應。嚴寧等[29]研究發(fā)現(xiàn)，抑制ERK1/2信號通路后可緩解心肌缺血再灌注大鼠所出現(xiàn)的炎癥損傷。在幽門螺桿菌所致的大鼠腸黏膜炎性反應中，田華等[30]研究發(fā)現(xiàn)抑制ERK通路可減輕胃炎大鼠胃黏膜的炎性反應。在非酒精性脂肪肝病中，廖媛等[31]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)TLR4、ERK1/2基因及蛋白表達，可抑制炎癥反應，減輕肝臟炎癥。

圖6 PD98059 作用后白頭翁湯對 LPS 作用的RIMVECs IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 表達的影響Fig.6 Effects of Pulsatilla decoction on the expression of IL-6, IL-8, IL-1β and TNF-α in RIMVECs induced by LPS after PD98059 treatment

前期實驗室研究表明20 μg·mL-1的白頭翁湯對細胞無毒性[13]。筆者發(fā)現(xiàn)20 μg·mL-1的白頭翁湯處理可以顯著降低LPS誘導的TLR4、TRAF6、ERK1/2基因及蛋白的表達。隨后使用ERK1/2信號通路上的特異性抑制劑PD98059，觀察白頭翁湯與抑制劑在抑制P-ERK蛋白表達及LPS所誘導的RIMVECs炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α分泌情況的作用效果差異。PD98059可通過特異性抑制其上游蛋白激酶MEK從而阻斷ERK1/2信號通路的激活[32]，其被廣泛應用于癌癥的研究中[33-34]。抑制劑PD98059抑制了LPS所引起的ERK1/2磷酸化及其下游炎性因子的分泌。表明ERK信號通路是LPS誘導炎性因子分泌，損傷RIMVECs細胞的主要靶點之一。白頭翁湯在抑制ERK1/2磷酸化水平上與抑制劑組相當，并可顯著降低LPS所誘導的炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α含量的高表達，且白頭翁湯下調(diào)炎性因子表達的效果與ERK1/2抑制劑相似，無統(tǒng)計學差異。這提示EKR1/2可能是白頭翁湯抑制炎癥反應保護RIMVECs的主要靶點之一。本試驗從細胞水平證實了白頭翁湯可抑制 LPS 刺激 RIMVECs 所引起的IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α的高表達，并通過 PD98059 阻斷試驗，初步認為其機制可能與白頭翁湯抑制ERK1/2信號通路有關，ERK1/2信號通路可能是白頭翁湯作用的主要靶位之一。以上說明，白頭翁湯可通過抑制TLR4-ERK1/2 信號通路，降低 LPS所引起的細胞炎性反應，從而達到保護機體的目的。此外由于LPS激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，可引起多條信號通路間的級聯(lián)反應，且白頭翁湯多成分、多靶點，除了抑制LPS激活ERK1/2通路外，是否還作用于其他胞內(nèi)通路，都需進一步的試驗進行研究探討。

4 結(jié) 論

白頭翁湯通過抑制TLR4-ERK1/2 信號通路上TLR4、TRAF6、ERK基因及蛋白的表達抑制LPS所誘導的RIMVECs炎性反應，發(fā)揮抗炎作用。