何婭娣?吳振權(quán)?侯國(guó)良

【摘要】目的 探討血漿環(huán)狀RNA_0002867（circ_0002867）對(duì)HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌（肝癌）的診斷價(jià)值。方法 分析已發(fā)表的測(cè)序結(jié)果，篩選在肝癌患者的組織和血漿中同時(shí)高表達(dá)的環(huán)狀RNA，通過(guò)微滴數(shù)字PCR（ddPCR）檢測(cè)35例HBV相關(guān)性肝癌患者（肝癌組）及30例HBV相關(guān)性肝硬化患者（肝硬化組）血漿circ_0002867表達(dá)水平，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)2組患者的血清甲胎蛋白水平，應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯(lián)合對(duì)HBV相關(guān)性肝癌的診斷價(jià)值。結(jié)果 在肝癌患者的組織和血漿中同時(shí)高表達(dá)的環(huán)狀RNA中取交集篩選出circ_0002867行進(jìn)一步驗(yàn)證。肝癌組血漿circ_0002867表達(dá)水平為（29.63±11.56）copies/ml，高于肝硬化組的（19.15±11.57）copies/ml（P < 0.001）;血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯(lián)合診斷HBV相關(guān)性肝癌的ROC曲線下面積分別為0.725（95% CI 0.600～0.828）、0.670 （95% CI 0.542～0.781）、0.810（95%CI 0.693～0.896），血漿circ_0002867和血清甲胎蛋白兩者聯(lián)合提高了血清甲胎蛋白診斷HBV相關(guān)性肝癌的效能（P < 0.05）。結(jié)論 血漿circ_0002867聯(lián)合血清甲胎蛋白對(duì)診斷HBV相關(guān)性肝癌具有較好的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒;肝細(xì)胞癌;診斷;血漿;甲胎蛋白;環(huán)狀核糖核酸

Plasma circular RNA_0002867 as a diagnostic biomarker for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma He Yadi， Wu Zhenquan， Hou Guoliang. Health Management Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， He Yadi， E-mail： heyadi2015@ 126. com

【Abstract】Objective To investigate the diagnostic value of plasma circular RNA_0002867 （circ_0002867） for hepatitis B virus （HBV）-related hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The published sequencing results were analyzed to screen the high expression of circular RNAs in both tissues and plasma of HCC patients. The expression levels of plasma circ_0002867 were detected by digital droplet polymerase chain reaction （ddPCR） in 35 patients with HBV-related HCC and 30 patients with HBV-related liver cirrhosis. The serum alpha-fetoprotein （AFP） levels were determined by electrochemiluminescence in two groups. The receiver operating characteristic （ROC） curve was delineated to analyze diagnostic values of plasma circ_0002867， serum AFP and these two combined for HCC. Results The circ_0002867， which was highly expressed in both tissues and plasma of HCC patients， was screened for subsequent validation. The expression level of plasma circ_0002867 in the HBV-related liver cirrhosis group was significantly lower than that in the HBV-related HCC group （（19.15±11.57） copies/ml vs. （29.63±11.56） copies/ml; P < 0.001））. The area under ROC for plasma circ_0002867， serum AFP， and these two combined was 0.725 （95% CI 0.600-0.828）， 0.670 （95% CI 0.542-0.781） and 0.810 （95% CI 0.693-0.896）， respectively. The combination of serum AFP and plasma circ_0002867 significantly improved the diagnostic accuracy of serum AFP for HBV-related HCC （P < 0.05）. Conclusion Plasma circ_0002867 combined with serum AFP is a potential diagnostic biomarker for HBV-related HCC in clinical practice.

【Key words】Hepatitis B virus;Hepatocellular carcinoma; Diagnosis;Plasma;Alpha-fetoprotein;

Circular RNA

肝細(xì)胞癌（肝癌）主要由HBV感染引起，是我國(guó)第2常見(jiàn)的消化系統(tǒng)實(shí)體瘤，也是惡性腫瘤死亡的第2大原因[1]。肝癌的高病死率與其早期缺乏臨床癥狀、在發(fā)現(xiàn)時(shí)大部分已處于晚期密切相關(guān)[2]。目前臨床上常用的血清甲胎蛋白診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為39% ～ 64%和76% ～ 91%，其效能仍有待提高[3]。一項(xiàng)多中心的回顧性研究表明，Cmi（7個(gè)血清微RNA的組合）診斷肝癌的靈敏度和特異度分別為70% ～ 86%和80% ～ 91%[4]。環(huán)狀RNA （circRNA）與微RNA同屬于非編碼RNA。與微RNA相比，circRNA具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可耐受核酸外切酶，穩(wěn)定性更高。有研究顯示，血漿組合circRNA （circ_0000976，circ_0007750和circ_0139897）對(duì)直徑≤3 cm的肝癌具有較高的診斷效能，優(yōu)于血清甲胎蛋白[5]。本研究分析已發(fā)表circRNA測(cè)序結(jié)果，采用微滴數(shù)字PCR （ddPCR）檢測(cè)技術(shù)，探索血漿circRNA對(duì)診斷HBV相關(guān)性肝癌的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象及資料收集

選擇2019年1月至2020年12月佛山市第一人民醫(yī)院收治的35例HBV相關(guān)性肝癌患者為肝癌組;同期收集30例HBV相關(guān)性肝硬化患者為肝硬化組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18 ～ 80歲;②有慢性乙型肝炎病史;③經(jīng)肝病理活組織檢查（活檢）確診為肝癌或肝硬化;④臨床資料完整，在治療前采集外周血。排除標(biāo)準(zhǔn)：外周血RNA提取總量不足。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。分別記錄2組患者的性別、年齡、身高和體質(zhì)量，計(jì)算BMI。

二、血清甲胎蛋白檢測(cè)

于患者入院后治療前采用非抗凝干燥無(wú)菌真空管收集3～5 ml外周血，室溫下以1000轉(zhuǎn)/分離心5 min，取上清至EP管置-80℃保存;按照甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法，羅氏公司）說(shuō)明書(shū)操作要求及步驟，采用羅氏E601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血清甲胎蛋白水平。

三、血漿肝癌特異性circRNA篩選

分析5對(duì)肝癌組織及鄰近正常肝組織的circRNA表達(dá)譜，共得到191個(gè)高表達(dá)circRNA;10例HBV相關(guān)性肝癌患者及5例HBV相關(guān)肝硬化患者的血漿circRNA表達(dá)譜，共得到124個(gè)高表達(dá)circRNA[6-7]。circBase數(shù)據(jù)庫(kù)用于注釋差異circRNA。通過(guò)取交集，篩選出血漿肝癌特異性circRNA。

四、血漿采集及RNA提取

于患者入院后治療前使用經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉處理的試管采集約8 ml外周血，采集后2 h內(nèi)于4℃ 3000×g離心15 min獲取血漿，然后立即使用miRNeasy Mini試劑盒（Qiagen）提取血漿中總RNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

五、逆轉(zhuǎn)錄模板DNA（cDNA）

應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Perfect Real Time （TaKaRa），將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說(shuō)明書(shū)配置10 μl反應(yīng)體系，包括2 μl 5倍體積稀釋的PrimeScript 緩沖液，0.5 μl PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶混合物Ⅰ，0.5 μl隨機(jī)6核苷酸引物（100 μmol/L），RNA和水配置至10 μl。反應(yīng)程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。

六、dd PCR檢測(cè)

引物序列：circ_0002867正向?yàn)?-CCATG

CCACAGTCCGCAATG-3，反向?yàn)?-TCCAACTGC TCCACGACACA-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp。ddPCR使用20 μl反應(yīng)體系（2 μl cDNA，10 μl QX200 EvaGreen ddPCR Supermix，4 μmol/L上下游引物;

無(wú)酶水替代cDNA設(shè)置陰性對(duì)照）在QX200 ddPCR系統(tǒng)上進(jìn)行。向反應(yīng)體系中加入70 μl微滴生成油生成微滴，吸取40 μl微滴至96孔PCR板在T100TM PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃

5 min;95℃ 30 s，64℃ 60 s，循環(huán)45次;4℃ 5 min，

90℃ 5 min穩(wěn)定信號(hào);4℃保存。采用微滴分析儀和QuantaSoft軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

繪圖及統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 25.0和R 3.6.1。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)分布用M（Q25，Q75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。使用logisitic回歸分析（Enter法）納入血清甲胎蛋白和血漿circ_0002867兩個(gè)變量，建立回歸方程，繪制受試者工作特征（ROC） 曲線分析血清甲胎蛋白和血漿circ_0002867表達(dá)水平對(duì)HBV相關(guān)性肝癌的診斷效能;采用DeLong檢驗(yàn)分析2條ROC曲線之間的差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、肝硬化組與肝癌組患者的一般資料

共納入65例患者，其中肝硬化組30例、肝癌組35例，組間年齡構(gòu)成、性別構(gòu)成、BMI和肝功能child-pugh分級(jí)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。肝癌組血清甲胎蛋白水平高于肝硬化組（P < 0.05），見(jiàn)表1。

二、血漿肝癌特異性circRNA篩選結(jié)果

通過(guò)文獻(xiàn)[6]肝癌組織和鄰近正常肝組織的circRNA表達(dá)譜，以及文獻(xiàn)[7] HBV相關(guān)性肝癌患者及HBV相關(guān)肝硬化患者的血漿circRNA表達(dá)譜，取交集篩選出circ_0002867行進(jìn)一步驗(yàn)證，見(jiàn)圖1。其在肝癌組織及鄰近正常肝組織的差異倍數(shù)為3.804，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）為0.001;在HBV相關(guān)性肝硬化患者血漿的差異倍數(shù)為2.057，F(xiàn)DR < 0.001。

三、血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白對(duì)HBV相關(guān)性肝癌的診斷效能

肝癌組血漿circ_0002867表達(dá)水平為（29.63

±11.56）copies/ml，高于肝硬化組的（19.15± 11.57）copies/ml（t = 3.585，P < 0.001），見(jiàn)圖2A。ROC曲線分析顯示血漿circ_00028677診斷HBV相關(guān)性肝癌的曲線下面積（AUC）為0.725（95% CI 0.600 ～ 0.828），當(dāng)診斷臨界值為17.10 copies/ml時(shí)，靈敏度和特異度分別為85.7%和50.0%，其可作為血漿circ_00028677診斷HBV相關(guān)性肝癌的最佳臨界值，見(jiàn)圖2B。

血漿circ_0002867、血清甲胎蛋白及兩者聯(lián)合診斷HBV相關(guān)性肝癌 [Logit（P） = -2.910+0.003×甲胎蛋白+0.095×circ_0002867]的ROC AUC分別為0.725 （95% CI 0.600 ～ 0.828）、0.670 （95% CI 0.542 ～ 0.781）、0.810 （95% CI 0.693 ～ 0.896）。血漿circ_0002867和血清甲胎蛋白兩者聯(lián)合診斷提高了血清甲胎蛋白單一診斷HBV相關(guān)性肝癌的效能（Z = 2.483，P = 0.013），其他任2者比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。ROC曲線分析提示血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白聯(lián)合診斷HBV相關(guān)性肝癌的靈敏度和特異度分別為65.7%和90.0%，而血清甲胎蛋白單獨(dú)診斷HBV相關(guān)性肝癌的靈敏度和特異度分別為60.0%和80.0%，聯(lián)合診斷提高了診斷的靈敏度及特異度。

討論

在中國(guó)，大多數(shù)肝癌患者都有乙型肝炎相關(guān)病史，造成炎癥和肝細(xì)胞再生持續(xù)存在，炎癥和肝硬化同時(shí)存在使得肝癌的早期診斷更加困難[8]。肝癌的預(yù)后與治療時(shí)機(jī)至關(guān)重要，早期肝癌可通過(guò)手術(shù)或介入的方式取得良好的療效，但由于肝癌早期缺乏特異的臨床癥狀，很多患者在確診時(shí)已處于晚期，嚴(yán)重影響其預(yù)后。目前血清甲胎蛋白是診斷和判斷肝癌預(yù)后的重要標(biāo)志物之一，但其易受炎癥等指標(biāo)的影響。因此，急需尋找新的生物標(biāo)志物用于協(xié)助診斷肝癌。液體活檢通過(guò)檢測(cè)體液包括血液、尿液中的生物分子如RNA、DNA、蛋白等診斷疾病和預(yù)測(cè)患者預(yù)后，其與傳統(tǒng)組織活檢相比具有損傷小、取樣方便等優(yōu)勢(shì)。

本研究中，我們通過(guò)分析已發(fā)表測(cè)序數(shù)據(jù)，探索血漿circRNA在HBV相關(guān)性肝癌中的診斷價(jià)值。首先，我們分別篩選肝癌組織和血漿中circRNA的差異表達(dá)譜，通過(guò)取交集的方式，尋找到肝癌特異性circRNA （circ_0002867），2項(xiàng)研究中的測(cè)序結(jié)果表明circ_0002867在肝癌患者的癌組織和血漿中同時(shí)高表達(dá)。血液樣本是臨床中最常用的樣本之一，收集和保存運(yùn)輸方便，重復(fù)檢測(cè)可行性更強(qiáng)。本研究使用ddPCR檢測(cè)血漿circ_0002867表達(dá)水平，ddPCR為第3代PCR技術(shù)，不需要內(nèi)參基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)物質(zhì)的絕對(duì)定量，對(duì)檢測(cè)微量物質(zhì)較傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比更具優(yōu)勢(shì)[9]。研究顯示，肝癌組血漿circ_0002867表達(dá)水平高于肝硬化組，提示利用血漿circ_0002867診斷HBV相關(guān)性肝癌具有可行性。

血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白兩者聯(lián)合診斷與血清甲胎蛋白單一診斷HBV相關(guān)性肝癌的ROC AUC分別為0.810和0.670。與血清甲胎蛋白相比，血漿circ_0002867與血清甲胎蛋白兩者聯(lián)合診斷提高了其診斷效能，尤其是提高了靈敏度和特異度。因此，兩者聯(lián)合可更好地診斷HBV相關(guān)性肝癌。值得注意的是，circ_0002867來(lái)源于HBV相關(guān)性肝癌的組織和血漿中circRNA差異表達(dá)譜，此研究結(jié)果是否適用于非HBV相關(guān)性肝癌，尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，circ_0002867聯(lián)合血清甲胎蛋白可提高血清甲胎蛋白的診斷效能。結(jié)合circRNA耐酶穩(wěn)定和血液樣本易獲取的優(yōu)點(diǎn)，血漿circ_0002867聯(lián)合血清甲胎蛋白診斷HBV相關(guān)性肝癌可能具有更高的臨床價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-06-01）

（本文編輯：林燕薇）