黃文菲?張志海?譚慧鋒?李映梅?盧洋儀?陳嘉馨

【摘要】目的 探討糖原合成酶（GYS1）對非小細胞肺癌細胞增殖能力的影響。方法 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測正常人支氣管上皮樣細胞系HBE細胞和非小細胞肺癌細胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相對表達量。過表達NCI-H1299細胞的GYS1，構建GYS1過表達細胞模型，采用MTT增殖實驗、EdU增殖實驗評估細胞的增殖能力，應用平板克隆形成實驗評估細胞的克隆形成能力。結果 人非小細胞肺癌細胞NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA的表達水平高于人正常支氣管上皮樣細胞HBE的表達水平（P均< 0.001）。NCI-H1299-GYS1過表達細胞的GYS1 mRNA和蛋白相對表達量均上調（P均< 0.001）。過表達GYS1促進了NCI-H1299細胞的增殖和克隆形成（P均< 0.001）。結論 GYS1在非小細胞肺癌中高表達，過表達GYS1促進了非小細胞肺癌細胞的增殖。

【關鍵詞】非小細胞肺癌;糖原合成酶1;增殖

Effect of overexpression of glycogen synthase 1 on the proliferation of non-small cell lung cancer cells Huang Wenfei， Zhang Zhihai， Tan Huifeng， Li Yingmei， Lu Yangyi， Chen Jiaxin. Department of Respiratory， Nanhai Hospital of Guangdong Provincial Peoples Hospital， Foshan 528200， China

Corresponding author， Chen Jiaxin， E-mail： jxchenmd@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of glycogen synthase 1 （GYS1） on the proliferation of non-small cell lung cancer cells. Methods The relative expression levels of GYS1 mRNA in normal human bronchial epithelial cell line HBE cells， non-small cell lung cancer cell lines NCI-H661 and NCI-H1299 were quantitatively detected by quantitative real-time fluorescence PCR （qRT-PCR）. The NCI-H1299 cells overexpressing GYS1 were utilized to establish the GYS1 overexpression cell model. MTT assay and EdU proliferation experiment were adopted to evaluate the cell proliferation ability， and plate clone formation assay was employed to assess the cell clone formation ability. Results The expression levels of GYS1 mRNA in human non-small cell lung cancer cells NCI-H661 and NCI-H1299 were significantly higher than that in normal human bronchial epithelial cell HBE （both P < 0.001）. The relative expression levels of GYS1 mRNA and protein were significantly up-regulated in the NCI-H1299-GYS1 overexpressing cells （both P < 0.001）. Overexpression of GYS1 remarkably promoted the proliferation and clone formation of NCI-H1299 cells （both P < 0.001）. Conclusions GYS1 is highly expressed in non-small cell lung cancer. Overexpression of GYS1 promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells.

【Key words】Non-small cell lung cancer;Glycogen synthase 1;Proliferation

肺癌是人類健康的主要威脅之一，據(jù)估計2018年全球肺癌死亡人數(shù)達到180萬[1]。肺癌的病理學類型常見非小細胞肺癌和小細胞肺癌。85%的肺癌為非小細胞肺癌，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，失去了手術機會[2]。非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展關鍵驅動基因的深入研究，對患者和臨床醫(yī)師而言具有重要的意義。

代謝紊亂是許多腫瘤的特征。腫瘤對其代謝產(chǎn)物進行重新編程，以產(chǎn)生足夠的能量維持生存。糖原主要儲存在肌肉和肝臟中，在需要時作為能量供應。然而，非小細胞肺癌糖原代謝的改變及其分子機制仍然有待于進一步研究。糖原合成的關鍵酶之一糖原合成酶（GYS）包括2種亞型，即GYS1和GYS2。GYS1通常在肌肉、肺、心臟和腎臟中表達，而GYS2主要局限于肝臟[3]。研究表明，GYS1在缺氧條件下被迅速誘導，并與膠質母細胞瘤、乳腺癌和結腸癌細胞系中的糖原積累呈正相關[4]。GYS1的異常表達不僅降低了細胞糖酵解，而且增加了糖原反應性AMP激酶的激活，導致髓系白血病細胞的生長抑制[5]。然而，GYS1在非小細胞肺癌中的作用尚不明確，仍然有待于進一步研究。本研究旨在闡明GYS1在非小細胞肺癌細胞糖原代謝和增殖中的作用。

材料與方法

一、主要材料

正常人支氣管上皮樣細胞系HBE和人非小細胞肺癌細胞系NCI-H661、NCI-H1299購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。主要試劑包括青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone， 美國），Opti-MEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific， 美國），Lipofectamine 3000 （Lip 3000，Invitrogen， 美國），MTT（碧云天，中國），DMEM培養(yǎng)基（Gibco， 美國）;TRIzol試劑（BIOO Scientific， 美國），逆轉錄試劑（維諾贊， 中國），定量PCR試劑（Takara， 中國），RIPA裂解液（碧云天， 中國），二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（碧云天， 中國）;GYS1抗體（1∶1000， CST， 美國）;β-actin抗體（1∶2000， Santa Cruz Biotechnology， 美國）。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)

HBE正常人支氣管上皮樣細胞和NCI-H661、NCI-H1299人非小細胞肺癌細胞采用含胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（1∶9）進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均含有100 μg/ml的鏈霉素和青霉素。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。細胞培養(yǎng)箱條件設置為37℃、5% CO2。

2. 細胞轉染

轉染空載體質粒的NCI-H1299細胞為Vector組，轉染GYS1重組質粒的NCI-H1299細胞為GYS1組;細胞轉染的前1日，常規(guī)消化細胞并收集，離心洗滌1遍，制成單細胞懸液，計數(shù)后接種于24孔板（Corning， 美國）中，每孔細胞數(shù)1×105個;細胞轉染當日，取Opti-MEM轉染專用培養(yǎng)基稀釋質粒，移液槍吹打;加入Lip 3000，應用移液槍輕輕吹打，等待20 min;取Lip 3000在Opti-MEM中稀釋，移液槍輕輕吹打;取出前1日鋪板的細胞，將混合液加入對應各孔中，“8”字搖晃混勻;37℃、5% CO2培養(yǎng)條件繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)，48 h后檢測GYS1 mRNA的表達，72 h后檢測GYS1蛋白的表達。

3. 實時熒光定量逆轉錄PCR（qRT-PCR）檢測

應用TRIzol RNA提取試劑從GYS1過表達組和Vector組細胞中獲取總RNA，然后逆轉錄、qRT-PCR檢測mRNA表達水平。反應體系包括5 μl的SYBR premix（2倍稀釋）、2 μl的cDNA模板、1 μl的混合引物（上下游引物提前混合，減少上樣誤差）、2 μl的DEPC水，震蕩混勻。反應條件如下：95℃預變性30 s，95 ℃變性30 s，然后60℃退火20 s，40個循環(huán)，72℃延伸30 s。β-actin上游引物序列5-GAAGCTAAGTCCTGCCCTCA-3，下游引物序列5-CAGTGAGGACCCTGGATGTG-3，qRT-PCR產(chǎn)物長度為305 bp;GYS1上游引物序列5-C AGCGCGGACCAACAATTTC-3，下游引物序列5-TCCTCCCGAACTTTTCCTTCA-3，qRT-PCR產(chǎn)物長度為3474 bp。用2-△△Ct法分析基因的相對表達量，實驗重復3次，結果取平均值。

4. 蛋白免疫印跡法檢測

首先用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌Vector組和GYS1過表達組細胞1次，向6孔板中加入200 μl RIPA裂解液裂解細胞20 min，使裂解液充分接觸細胞，每10 min搖勻1次;蛋白濃度測定應用BCA法;按比例加載樣緩沖液金屬浴95℃蛋白變性5 min;SDS-PAGE電泳分離蛋白質;0.22 μm PVDF膜轉膜;5%牛奶封閉1 h;

雙蒸水清洗膜;加入一抗抗體（GYS1， 1∶1000;β-actin， 1∶2000）4℃過夜（最少16 h）;次日TBST洗膜液洗滌3遍，每次8 min;棄掉TBST洗膜液，加入二抗，室溫孵育1 h;TBST洗膜液洗滌3次，每次8 min;電化學發(fā)光（ECL）法曝光成像;結果用Gelpro軟件進行分析。

5. MTT檢測

使用二甲基亞砜（DMSO）溶解MTT粉末配成終濃度為5 mg/ml的MTT溶液，-20℃避光保存，使用時室溫溶解。取GYS1過表達組和對照（Vector）組細胞，制成單細胞懸液，96孔板鋪板，每孔加入5×103個細胞，每組4個復孔;周圍一圈加PBS;然后分別于檢測時間點（24、48、72、96 h），取出96孔板，每孔加入10 μl的MTT工作液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h;然后每孔加入100 μl的Formazan溶液溶解;在570 nm處測定吸光度（OD值）。

6. EdU增殖實驗

按照說明書采用EdU法檢測細胞增殖。細胞置于24孔板中培養(yǎng)24 h，加入100 μl EdU，用DAPI染色細胞核。熒光顯微鏡拍照并計數(shù)。實驗重復3次。

7. 克隆形成實驗

取Vector組和GYS1過表達組的細胞以1×103個/孔的細胞密度接種于6孔板;繼續(xù)培養(yǎng)7 ～ 14 d;多聚甲醛固定后結晶紫染色;用自來水洗滌細胞，拍照并計數(shù)，實驗重復3次，結果取平均值。

三、統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)處理和制圖，計量資料采用表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，NCI-H661、NCI-H1299的GYS1 mRNA相對表達量與HBE細胞間GYS1 mRNA的比較先采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義后采用Dunnet-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、GYS1在人非小細胞肺癌細胞中的表達

qRT-PCR檢測了正常人支氣管上皮樣細胞系HBE和非小細胞肺癌細胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相對表達量，結果顯示3種細胞中GYSI mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 923.11，P < 0.001），其中NCI-H661（Dunnet-t = 25.17，P < 0.001）、NCI-H1299（Dunnet-t = 43.73，P < 0.001）的GYS1 mRNA相對表達量均高于HBE細胞，見圖1。

二、GYS1過表達對非小細胞肺癌細胞NCI- H1299增殖的影響

相比NCI-H661細胞，GYS1 mRNA在NCI-H1299細胞中的相對表達量較低，因此本研究選擇過表達NCI-H1299細胞的GYS1，研究NCI-H1299細胞的變化。結果顯示，與Vector組相比，NCI-H1299-GYS1過表達組細胞的GYS1 mRNA（t = 20.62，P < 0.001）和蛋白（t = 41.27，P < 0.001）相對表達量上調，見圖2。成功構建NCI-H1299-GYS1過表達細胞模型后，MTT實驗檢測過表達GYS1對于NCI-H1299細胞增殖能力影響的結果顯示，細胞培養(yǎng)72 h后，GYS1過表達組的OD值大于Vector組的OD值（t = 11.56，P < 0.001），24 h和48 h的結果比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均> 0.05），見圖3。進一步通過EdU增殖實驗檢測過表達GYS1對于NCI-H1299細胞增殖能力的影響，結果顯示GYS1過表達組EdU陽性細胞數(shù)多于Vector組的EdU陽性細胞數(shù)（t = 18.59，P < 0.001），見圖4。以上結果提示GYS1過表達后，NCI-H1299細胞的增殖能力有所增加。

三、GYS1過表達促進了NCI-H1299細胞的克隆形成

平板集落形成實驗觀察NCI-H1299細胞在過表達GYS1前后克隆形成能力的變化，結果顯示過表達GYS1后，NCI-H1299細胞克隆形成能力有所增加（t = 18.59，P < 0.001），見圖5。

討論

GYS1是糖原合成最后一步的關鍵酶。GYS1突變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，已知GYS1缺乏可導致糖原貯積和細胞異常。GYS1的過度表達與急性髓細胞白血病和非小細胞肺癌的不良預后相關[6-7]。然而，我們?nèi)匀蝗狈ψ銐虻淖C據(jù)證明GYS1是否是癌癥的一個關鍵潛在標志。由于非小細胞肺癌是肺癌最常見的亞型，預后較差，因此有必要對GYS1進行研究。

研究表明糖原在癌細胞存活中起著關鍵作用。例如，抑制糖原分解可誘導胰腺癌細胞凋亡，乳腺癌、腎癌和卵巢癌細胞系中的糖原含量與增殖呈負相關。代謝重編程與腫瘤的發(fā)展和進展有關，甚至使腫瘤易受化學治療的影響[8-9]。值得注意的是，在重新連接葡萄糖代謝的過程中，癌細胞的化學治療或放射治療抵抗力也發(fā)生了相應的變化[9]。與此一致，GYS1與急性髓系白血病的不良預后有關[6]。

本研究顯示，GYS1在人非小細胞肺癌細胞的表達水平高于正常人支氣管上皮樣細胞，提示GYS1在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。后續(xù)細胞功能研究結果顯示，GYS1促進了NCI-H1299細胞的增殖。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，GYS1過度表達促進了腎透明細胞癌的增殖，是腎透明細胞癌不良預后因素。

綜上所述， GYS1在人非小細胞肺癌細胞的表達水平高于正常人支氣管上皮樣細胞，且GYS1促進了NCI-H1299細胞的增殖，揭示了GYS1可能是非小細胞肺癌的潛在藥物靶點。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-07）

（本文編輯：林燕薇）