蔣書(shū)美，施鵬，王立超，王璨，石開(kāi)虎

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心胸外科，安徽 合肥 230601）

0 引言

多種心血管疾病的中晚期階段主要發(fā)生心臟重塑，心肌纖維化是心臟重構(gòu)的主要病理特點(diǎn)，例如心肌梗死、房顫等[1]。因此對(duì)心肌纖維化發(fā)生機(jī)制的研究具有重要的臨床價(jià)值。心肌組織中細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）成分生成增加是心肌纖維化主要的病理特征，ECM主要以I型膠原分子（Collagen I）為主[2]?，F(xiàn)已清楚心肌纖維化的機(jī)制是心臟成纖維細(xì)胞（CFs）的激活，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和Collagen I等合成增加[3]。

細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1），又叫CD54，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員[4]。主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與其他細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)組分的結(jié)合和相互作用；研究已證明ICAM-1參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長(zhǎng)及分化、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程[5]。近年來(lái)ICAM-1在心臟疾病中的研究也越來(lái)越多。本實(shí)驗(yàn)將用異丙腎上腺素（ISO）增加大鼠心臟后負(fù)荷構(gòu)建心肌纖維化動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物模型組中ICAM-1的表達(dá)變化，來(lái)研究ICAM-1在心肌纖維化過(guò)程中的可能作用，為其更深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD雄性大鼠40只，體重（40±2）g。購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（皖）2018-001。

1.1.2 主要試劑：胰蛋白酶（加拿大WISENT公司），蛋白酶抑制劑PMSF、細(xì)胞組織裂解液RIPA（上海Beyotime公司），Western-Blot相關(guān)蛋白分子的一抗、二抗（萬(wàn)類(lèi)生物科技公司），ICAM-1及相關(guān)膠原分子引物（上海普迪生物技術(shù)公司）。

1.1.3 主要儀器：電泳儀、顯影機(jī)等相關(guān)Western-Blot設(shè)備（上海Tanon公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），顯微鏡（日本Olympus公司），PCR擴(kuò)增儀、逆轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌纖維化動(dòng)物模型的建立：取SD大鼠40只，平均分為ISO模型組和對(duì)照組。ISO模型組小鼠皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg，2周。對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，2周。實(shí)驗(yàn)后處死大鼠，取心臟組織標(biāo)本。

1.2.2 Western-Blot法檢測(cè)ICAM-1等相關(guān)分子蛋白的表達(dá)：用配制好的混合裂解液提取組織總蛋白。加樣后分別予以80 V，30 min后改120 v電泳1 h左右。接著設(shè)定恒流200 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后將膜放入TBST配制的5%脫脂牛奶，搖床慢搖封閉1.5 h。最后孵育一抗和二抗。顯影：吸取等量ThermoECL發(fā)光A液和B液放入EP管中混勻，將其滴入PVDF膜的蛋白面上，進(jìn)行顯影拍照，選擇曝光時(shí)間，保存圖片。

1.2.3 qRT-PCR法檢測(cè)ICAM-1等相關(guān)分子mRNA的表達(dá)：用預(yù)冷的TRIzol溶液提取組織的總RNA，提取的RNA加入DEPC水吹勻后測(cè)濃度跟純度確保260 nm/280 nmOD值在1.8~2.0之間。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，目標(biāo)cDNA的擴(kuò)增（qRT-PCR）：在超凈工作臺(tái)，八聯(lián)管中每孔加入cDNA樣本1.6 uL，被擴(kuò)增基因的引物3.2 uL，然后在避光的環(huán)境下每孔加入5.2 uL的TbGreen至總反應(yīng)體系總量為10 uL。將八連管放入PCR機(jī)子中，進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算各組目標(biāo)mRNA的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采取SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素變量?jī)山M之間用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌纖維化模型心臟病理學(xué)改變。大鼠心臟組織切片HE、Masson染色所示：較對(duì)照組比，ISO模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維明顯增多，排列紊亂，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心肌組織的HE、Masson染色圖×400

2.2 ISO模型組心肌組織ICAM-1分子蛋白的表達(dá)。Western-Blot法檢測(cè)結(jié)果所示：ISO模型組大鼠心肌組織中α-SMA、Collgen I和ICAM-1分子蛋白表達(dá)都較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠心肌組織中目的分子的蛋白表達(dá)變化

2.3 ISO模型組心肌組織ICAM-1分子mRNA的表達(dá)。qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果所示：ISO模型組大鼠心肌組織中α-SMA、Collgen I和ICAM-1分子mRNA的表達(dá)量都較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

心肌纖維化現(xiàn)被廣泛認(rèn)為是眾多心血管疾病的終末病理表現(xiàn)，主要有修復(fù)替代性纖維化和間質(zhì)代償性纖維化兩種形式，其都涉及到CFs的激活。心肌發(fā)生纖維化的標(biāo)志是α-SMA和Collagen I的合成增加，最終導(dǎo)致ECM增多出現(xiàn)心肌肥厚、心肌收縮力降低等。ICAM-1參與眾多的生理病理過(guò)程，例如Harjunp?? H等人報(bào)道過(guò)其在免疫反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境中的作用，還描述了惡性腫瘤細(xì)[6]胞如何利用細(xì)胞粘附分子來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)Fernandez IE等人研究發(fā)現(xiàn)可溶性ICAM-1在肺纖維化小鼠外周血中升高，且與纖維化程度密切相關(guān)，組織結(jié)合性ICAM-1在肺勻漿中也升高。但其在心肌纖維化中的作用研究較少。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠ISO模型實(shí)驗(yàn)組的心肌組織發(fā)生了病理性的纖維化肥厚并檢測(cè)到Collagen I和α-SMA在蛋白和mRNA水平上表達(dá)增加，說(shuō)明構(gòu)造心肌纖維化動(dòng)物模型成功。與此同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組相比，在ISO模型組中ICAM-1表達(dá)是升高的，其結(jié)果與Samir Bolívar等人研究報(bào)道是一致的，說(shuō)明ICAM-1參與促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生過(guò)程。但本實(shí)驗(yàn)只是從體內(nèi)動(dòng)物水平上的初步驗(yàn)證，ICAM-1在心肌纖維化的具體調(diào)控通路機(jī)制還有待于在細(xì)胞水平上的深入研究。