史方富,崔紅旺,孫 博

成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡維持著人體正常的骨量，成骨細(xì)胞形成缺陷或者異常凋亡將會(huì)引起骨質(zhì)疏松等一系列疾病[1]。炎癥因子在導(dǎo)致骨質(zhì)疏松中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 是經(jīng)典的多效促炎性細(xì)胞因子，其表達(dá)水平與骨損傷呈正相關(guān)[2]，實(shí)驗(yàn)研究[3]發(fā)現(xiàn),TNF-α可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。自噬是機(jī)體內(nèi)的一種自我修復(fù)程序，可以清除受損的細(xì)胞器，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的自噬在維持骨穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，自噬活性降低會(huì)加速細(xì)胞凋亡[4]。本研究觀察小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞株的自噬在TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用，為治療骨質(zhì)疏松尋找潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源、試劑和儀器小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。TNF-α、雷帕霉素(RAP)、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，DMEM-F12 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司，微管相關(guān)蛋白Ⅰ/Ⅱ輕鏈3(LC3-Ⅰ/Ⅱ)抗體、內(nèi)參GAPDH抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)于Cell Signaling公司，聚氟乙烯膜購(gòu)于Millipore公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司，Elx800 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio Tek公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)分組MC3T3-E1成骨細(xì)胞株接種于DMEM-F12培養(yǎng)基(含10% FBS+1%青霉素/鏈霉素)，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，得到培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行分組：① 對(duì)照組——培養(yǎng)液不做處理；② TNF-α觀察組——培養(yǎng)液中加入40 μg/L TNF-α；③ RAP觀察組——培養(yǎng)液中加入100 nmol/L RAP作用1 h后再加入40 μg/L TNF-α。

1.3 MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖活力的MTT法檢測(cè)將3組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，按照1.2項(xiàng)分組處理后培養(yǎng)68 h，然后每孔加入0.5 μg/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，加入二甲基亞砜，酶標(biāo)儀470 nm處檢測(cè)吸光度的變化，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=(1-觀察組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 MC3T3-E1成骨細(xì)胞的凋亡檢測(cè)將3組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，按照1.2項(xiàng)分組處理后培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集各組MC3T3-E1細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書加入膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)，染色30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+細(xì)胞)的占比。

1.5 MC3T3-E1成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)的免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)將3組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，按照1.2項(xiàng)分組處理后培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集各組MC3T3-E1成骨細(xì)胞，加入蛋白裂解液，每組取10 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)印至聚氟乙烯膜。10%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)掃描并進(jìn)行定量分析。對(duì)照內(nèi)參計(jì)算LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 自噬對(duì)TNF-α誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響見(jiàn)表1和圖1。MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率：3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)； TNF-α觀察組、RAP觀察組均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；TNF-α觀察組明顯高于RAP觀察組(P<0.01)。

表1 3組MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的比較

圖1 3組MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

2.2 自噬在TNF-α誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷中的變化見(jiàn)圖2、3。MC3T3-E1成骨細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值：對(duì)照組、TNF-α觀察組和RAP觀察組分別為0.10～0.50(0.22±0.07)、0.03～0.14(0.09±0.02)和0.96～1.52(1.25±0.26)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.824，P<0.001)；RAP觀察組明顯高于對(duì)照組和TNF-α觀察組(P<0.01)；TNF-α觀察組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

圖2 自噬蛋白的Western Blot檢測(cè)

圖3 3組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較 與對(duì)照組比較：**P<0.01；與TNF-α觀察組比較：##P<0.01

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥已成為中老年人骨痛、骨折的主要原因，抗骨吸收是采用雌激素、二膦酸鹽類藥物治療骨質(zhì)疏松的主要用藥目的，但其治療效果欠佳，尋找骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)仍然是近幾年來(lái)研究者們關(guān)注的重點(diǎn)[6]。研究[7-8]顯示，促炎性細(xì)胞因子在骨代謝中起重要作用，TNF-α是炎癥通路中的一個(gè)關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子。臨床流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均顯示，TNF-α表達(dá)升高與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，而且TNF-α可以抑制骨髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[9-10]，從而激活核因子-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[11]。本研究中，TNF-α可以明顯抑制小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖和促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。研究[12]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者處于自噬抑制狀態(tài)，這被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松發(fā)病的一種新機(jī)制，自噬體的形成是自噬激活的標(biāo)志，LC3-Ⅱ是自噬體的關(guān)鍵組成蛋白，自噬發(fā)生時(shí)大量 LC3-Ⅰ水解成LC3-Ⅱ，實(shí)驗(yàn)中常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的比值反映細(xì)胞自噬激活的程度。薛凱文 等[13]的研究顯示,成骨細(xì)胞自噬通路被激活后，TNF-α的表達(dá)也會(huì)顯著降低。本研究中，TNF-α觀察組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明MC3T3-E1成骨細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后，抑制了自噬；對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖抑制和凋亡的分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α觀察組細(xì)胞抑制率和凋亡率均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明TNF-α抑制自噬后，MC3T3-E1成骨細(xì)胞生長(zhǎng)得到抑制，細(xì)胞凋亡增加。為了驗(yàn)證這一結(jié)果的可靠性，使用自噬激動(dòng)劑RAP干預(yù)后，RAP觀察組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著高于TNF-α觀察組，說(shuō)明自噬顯著激活；RAP觀察組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著低于TNF-α觀察組，說(shuō)明拮抗TNF-α可明顯增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞自噬，進(jìn)一步顯著降低TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞的損傷。

綜上所述，自噬在TNF-α誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定作用，增強(qiáng)自噬可以顯著降低TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞的損傷。