趙 琦，陳玲玲，孫 超

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，712100)

近年來，中國肉產(chǎn)量和消費量都呈現(xiàn)快速增長趨勢，豬肉是我國國民不可缺少的肉食，我國豬肉消費量占世界總量的50%，2019年我國豬肉進口量總計為210.8萬t，國內(nèi)豬肉產(chǎn)量無法滿足國民需求，這就要求我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)需要快速發(fā)展。我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展不僅要求數(shù)量的增長，質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟效益需要共同發(fā)站，目前生豬養(yǎng)殖已從散戶養(yǎng)殖逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧s化、規(guī)?；B(yǎng)殖。隨著人工授精技術的成熟和推廣，人工授精技術已成為目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中的重要手段之一，該技術的應用能夠解決公母豬之間因體型差異不能配種的問題、大量減少種公豬飼養(yǎng)數(shù)量及疾病的傳播從而在人力、財力、物力等方面節(jié)約了成本，提高經(jīng)濟效益。精液保存是人工授精技術中的重要環(huán)節(jié)，豬精子對溫度敏感，溫度過低會導致精子冷休克，極易造成精子損傷，且這種現(xiàn)象是不可逆的，通常只有50%或者更少的精子能在低溫保存過程中存活。研究表明常溫保存的精子存活率高、妊娠率高，冷凍保存的精液存活率低，且成本更高，因此在實際生產(chǎn)中大多使用常溫保存的豬精液用于人工授精。豬精液常溫保存的原理是利用弱酸環(huán)境抑制精子的運動，隨著保存時間的延長活性氧會造成精子損傷，此外，采集的精液本身含有微生物，隨著保存時間的延長大量繁殖，消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)的同時還會造成精子凝集，影響精子的運動能力，并降低受精能力和早期胚胎發(fā)育能力。沒食子酸(gallic acid) 是一種天然有機酚酸，具有較強的抗氧化性，抑菌及抗炎等生物學作用。GA對機體產(chǎn)生的多余活性氧類有顯著的清除作用，如DPPH自由基、羥自由基等，對脂質(zhì)過氧化也有明顯抑制效應，同時具有清除一氧化氮(NO)的能力。

1 材料方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗豬精液 試驗精液來源于3頭14月齡、身體健康的長白公豬，手握法采集精液，收集中段富含精子部分，過濾后放入便攜式保溫箱，迅速帶回實驗室。選取色澤、氣味正常、CASA檢測后活率80%以上的精液待用。

1.1.2 試劑與儀器 沒食子酸，純度≧98%(分析標準品)，葡萄糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸氫鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、(北京索萊寶科技有限公司)，DAPI (10Ml，Solarbio )、FITC-PNA(1mg，Sigma)三羥基氨基甲烷(Tris) (北京索萊寶科技有限公司)。

主要儀器包括：豬精液質(zhì)量檢測系統(tǒng)、倒置熒光顯微鏡、離心機、立式壓力蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋、17℃恒溫箱、37℃培養(yǎng)箱、電子天平、微量移液器。

1.2 試驗方法

1.2.1 配置精液稀釋液 精液基礎稀釋液的配制：準確稱量葡萄糖37.15 g、二水合檸檬酸鈉6.0 g、碳酸氫鈉1.25 g、氯化鉀0.75 g、EDTA1.25 g于滅菌燒杯中，取1 L雙蒸水對試劑進行溶解。待完全溶解后，用0.22 μmol/L濾菌膜過濾于無菌玻璃瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸儲存液的配制：稱取10 mg沒食子酸，用1 mL DMSO充分溶解，配制成10mg/mL的沒食子酸儲存原液，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原精的質(zhì)量檢測 原精活率檢測：于37℃加熱板上預熱好的專用載玻片上滴10 μL原精，蓋預熱好的蓋玻片后，置于37 ℃恒溫載物臺上利用豬用CASA系統(tǒng)檢測精子活率，精子活率85%以上的精液用于后續(xù)試驗。

1.2.3 精液的稀釋與保存 用基礎稀釋液對原精進行稀釋，使其混合均勻。分裝于已滅菌離心管中并編號，用毛巾包裹，待精液溫度與室溫相近后放置在17 ℃恒溫箱中，至少每隔12 h 緩慢搖動精液樣品一次，每隔24 h 檢查精子活率(以精子活率大于60%的天數(shù)為有效保存天數(shù))。

1.2.4 精子活率及A+B級精子數(shù)檢測 保存過程中每隔24 h進行一次活率和A+B級精子數(shù)檢測，從17℃恒溫箱中取出精液樣品，緩慢搖勻后吸取中部樣品100 μL于1.5 mL離心管中，置于預熱好的37 ℃恒溫水浴鍋孵育5 min，孵育結(jié)束后取10 μL樣品滴至預熱后的載玻片，利用豬用CASA系統(tǒng)檢測精子活率以及A+B級精子數(shù)。每個樣品隨機選取5個視野進行測定并計數(shù)。

1.2.5 精子質(zhì)膜完整性檢測 取100 μL精液樣品于1.5 mL 離心管中，置于預熱好的37 ℃水浴中10 min使精子活化，加入配好的0.2μLSYBR-14 工作染液緩慢吹打混勻，37℃孵育7～10 min；加入 1μLPI 工作染液緩慢吹打混勻，孵育7～10 min。孵育結(jié)束后取10 μL 樣品滴于載玻片，蓋上蓋玻片，為防止熒光淬滅，快速置于熒光顯微鏡下拍照，選擇至少5個清晰的視野。

1.2.6 精子頂體完整性檢測 取30 μL精液滴于多聚賴氨酸處理粘附載玻片的一端，利用干凈蓋玻片均勻的涂抹于整個載玻片上，室內(nèi)自然風干；風干后滴加無水甲醇用于固定，甲醇揮發(fā)后取30 μLDAPI染液滴于載玻片，用蓋玻片輕刮至完全覆蓋樣品，室溫避光染色7～10 min；取30 μL FITC-PNA工作液，均勻的滴加于載玻片上，覆蓋樣品，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min；孵育結(jié)束后用PBS沖洗玻片，自然風干后加少量甘油，蓋上干凈長蓋玻片，為防止熒光淬滅快速置于熒光顯微鏡下拍照，選取至少5個細胞數(shù)在兩百左右的視野。

1.2．7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0對各組數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析，比較各組間的差異顯著性，所有指標均采以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸對豬精子活率的影響

由表1可知，保存第1、9 天時，9 μg/mL組顯著高于對照組(P<0.05)；保存第3天時，3、5、7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)；第5天時，5、7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)；第7天時，7、9 μg/mL組均顯著高于對照組(P<0.05)，第3～9天時10 μg/mL顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 不同濃度的沒食子酸對豬精子活率的影響

2.2 沒食子酸對豬A+B級精子數(shù)的影響

由表2可知，保存第1天，各濃度組與對照組相比無顯著差異間(P>0.05)；保存第3～9天時 ，10μg/mL顯著低于對照組(P<0.05)；保存第5、9天時 ，9 μg /mL組顯著高于對照組(P<0.05)；第7天時，9 μg/mL組極顯著高于對照組(P<0.01)。

表2 不同濃度的沒食子酸對豬A+B級精子數(shù)的影響

2.3 沒食子酸對豬精子質(zhì)膜完整性的影響

由圖1可知，保存第1天各組間無顯著差異(P>0.05)；保存第3 d，9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第5 d，6、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，10 μg/mL組顯著低于對照組(P<0.05)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第7 d，6、7、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照組(P<0.05)保存第9 d，9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05).

圖1 不同濃度的沒食子酸對豬精子質(zhì)膜完整性的影響

2.4 沒食子酸對豬精子頂體膜完整性的影響

由圖2可知，保存第1天，9μg/mL組精子頂體完整性顯著高于對照組(P<0.05)，其他各濃度組間無顯著差異間(P>0.05)；保存第3天，9μg/mL組精子質(zhì)膜頂體極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第5天， 5、8μg/mL組精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照組(P<0.05)，9 μg/mL組精子質(zhì)膜頂體極顯著高于對照組(P<0.01)，10 μg/mL組顯著低于對照組(P<0.05)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)；保存第9天，5、8、9 μg/mL組精子質(zhì)膜完整性極顯著高于對照組(P<0.01)，其他濃度組與對照組間無顯著差異(P<0.05)。

圖2 不同濃度的沒食子酸對豬精子頂體完整性的影響

3 討論與結(jié)論

豬精液常溫保存時目前養(yǎng)殖場使用做多的精液儲存方式，延長豬精液保存時間，不僅可以提高種公豬的利用率，也可以降低豬畜牧生產(chǎn)成本。精液稀釋劑中加入抗氧化劑是延長豬精液保存時間和提高保存精液質(zhì)量的有效方法，已有多種物質(zhì)被當做抗氧化劑添加到稀釋液中用于精液保存。

觀察精液顏色、氣味是評估精質(zhì)量的第一步，利用CASA系統(tǒng)檢測精子的活率、活力、A+B級精子數(shù)以及利用試劑盒檢測精子的脂膜、頂體完整性是最常用的方法，精液的質(zhì)量與保存時間、方式、稀釋劑配方、操作方法、操作環(huán)境有關。研究表明，大部分抗氧化劑按適當劑量加入精液稀釋劑都有利于提高精子活率、活力、運動方式和動力學參數(shù)等，一些研究指出抗氧化劑加入精液稀釋劑可有效防止精子脂質(zhì)過氧化，影響精子活率以及保存時間。沒食子酸作為抗氧化劑，可以降低脂質(zhì)過氧化、提高抗氧化能力。目前為止，尚未有沒食子酸在豬精液常溫保存方面的研究，因此本實驗在普通精液稀釋劑中加入不同濃度的GA，稀釋豬精液后17℃保存，發(fā)現(xiàn)GA可以不同程度的提高豬精子活率、A+B級精子數(shù)。精子質(zhì)膜和頂體完整是精子存活、受精的重要條件，本文研究了GA對豬精子質(zhì)膜和頂體完整的影響，結(jié)果表明沒食子酸可以提高精子質(zhì)膜和頂體完整，對于精子而言，低濃度的ROS是有益的，低濃度的ROS有利于通過生成cAMP和酪氨酸磷酸化來調(diào)控精子獲能 、精子頂體完整及精卵結(jié)合，但隨著保存時間的延長，精液中產(chǎn)生的ROS不能去除，過量的ROS會導致過度的脂質(zhì)過氧化，破壞精子膜上的多不飽和脂肪酸與磷脂，造成精子的質(zhì)膜損傷，破壞頂體的完整性、DNA損傷和精子退化，有研究表明GA通過降低脂質(zhì)過氧化作用，增強抗氧化能力、降低DNA斷裂從而保護保護睪丸組織及減緩藥物致使的生殖機能損傷，此外，因GA能降低細胞內(nèi)活性氧水平的能力，在黃牛卵母細胞體外成熟液中添加適量的沒食子酸能提高卵母細胞成熟的質(zhì)量及其胚胎發(fā)育能力，因此GA對豬精子活率、保存時間及膜完整性的影響可能是由于其抗氧化性。

綜上所述，精液稀釋劑中添加1-9 μg/mL沒食子酸可在保存第1-3天提高豬精液的精子活率、 A+B級精子數(shù)、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，7、9 μg/mL 沒食子酸在保存第3-9天提高豬精液的精子活率、 A+B級精子數(shù)、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。