柳 林，王曉玲，趙夢(mèng)姣，陳 靜

(1.煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心)

2019年5月，在山東省煙臺(tái)市啟動(dòng)了白羽肉雞主要疫病凈化示范區(qū)建設(shè)項(xiàng)目，這是全國(guó)第一個(gè)家禽疫病區(qū)域凈化項(xiàng)目，旨在深入落實(shí)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》，推動(dòng)《規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)主要?jiǎng)游镆卟艋蜔o(wú)害化排放技術(shù)集成與示范》項(xiàng)目實(shí)施，對(duì)推動(dòng)我國(guó)家禽主要疫病凈化意義重大。禽白血病是白羽肉雞主要凈化疫病，是由禽白血病毒(ALV)引起的一類(lèi)腫瘤性疾病。在雞群中流行的主要有六個(gè)亞群，其中ALV-J 亞群致病性和傳染性最強(qiáng)，主要傳播方式為垂直傳播和水平傳播。目前該病尚無(wú)有效的治療方法和疫苗預(yù)防，對(duì)種雞群實(shí)施監(jiān)控和凈化是控制該病有效的方法之一，最常用的檢測(cè)方法是檢測(cè)p27 抗原，檢測(cè)的樣品為稀蛋清、泄殖腔拭子、胎糞等，其中應(yīng)用最廣泛是蛋清p27抗原檢測(cè)。本文利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法對(duì)泄殖腔棉拭子、蛋清 p27 抗原進(jìn)行檢測(cè)，分析其結(jié)果的差異性，進(jìn)一步評(píng)估泄殖腔棉拭子p27 抗原檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用的局限性。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

抽樣原則為場(chǎng)點(diǎn)全覆蓋、隨機(jī)性、真實(shí)性，保證所采的樣品具有代表性。在全市10個(gè)縣市區(qū)抽取養(yǎng)殖場(chǎng)戶(hù)31個(gè)，包括2個(gè)祖代場(chǎng)、29個(gè)父母代場(chǎng)，共采集種蛋900枚、咽喉/泄殖腔棉拭子900份。要求種蛋新鮮，咽喉/泄殖腔棉拭子置于同一個(gè)離心管中，種蛋和咽喉/泄殖腔棉拭子，應(yīng)來(lái)自于同一棟舍。

1.2 樣品處理

1.2.1 種蛋處理 種蛋放在蛋盤(pán)中冷藏2 d，恢復(fù)至室溫，酒精棉球擦拭雞蛋大頭進(jìn)行滅菌，再用鑷子在雞蛋的大頭處打開(kāi)一小孔，可見(jiàn)氣室，從破殼處沿著蛋殼內(nèi)壁挑破蛋膜，使用1 mL剪去尖頭滅菌槍尖抽取蛋清約1 mL，放于1.5 mL EP管中，冷凍保存。

1.2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子采集及處理 雞只呈側(cè)臥位保定，手持棉簽伸入雞喉頭內(nèi)或泄殖腔約1.5～2.0 cm，棉頭緊帖腔內(nèi)壁旋轉(zhuǎn) 2～3 圈，取出后裝入EP管中，折斷棉簽保留棉頭，采集樣品后盡快送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。加入IDEXX 試劑盒中配備的樣品稀釋液1 mL，冷藏保存過(guò)夜，檢測(cè)前2 000r/min 離心 5min，取上清液。

1.3 檢測(cè)方法

檢測(cè)蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司(批號(hào)：FR481)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 蛋清p27抗原檢測(cè)結(jié)果

在10個(gè)縣市區(qū)中，有5個(gè)縣檢測(cè)出p27抗原陽(yáng)性，分別位于萊陽(yáng)市、海陽(yáng)市、萊州市、招遠(yuǎn)市、牟平區(qū)，陽(yáng)性率分別為2.2%、1.7%、1.7%、3.3%、0.7%；全市采集共900枚種蛋，檢出p27抗原陽(yáng)性9份，總體陽(yáng)性率為1.0%，詳見(jiàn)表1和圖1。

表1 蛋清禽白血病p27抗原檢測(cè)結(jié)果

圖1 蛋清禽白血病p27抗原檢測(cè)結(jié)果

2.2 咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原檢測(cè)結(jié)果

在10個(gè)縣市區(qū)中，有6個(gè)縣檢測(cè)出p27抗原陽(yáng)性，分別位于萊陽(yáng)市、棲霞市、海陽(yáng)市、蓬萊市、招遠(yuǎn)市、牟平區(qū)，陽(yáng)性率分別為3.3%、1.7%、3.3%、1.3%、7.8%、1.3%；900份咽喉/泄殖腔棉拭子，檢出p27抗原陽(yáng)性19份，總體陽(yáng)性率為2.1%，詳見(jiàn)表2和圖2。

表2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原檢測(cè)結(jié)果

圖2 咽喉/泄殖腔棉拭子禽白血病p27抗原檢測(cè)結(jié)果

2.3 檢測(cè)結(jié)果比較使用美國(guó)IDEXX公司p27抗原試劑盒對(duì)蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子進(jìn)行檢測(cè)，檢出蛋清陽(yáng)性9份，陽(yáng)性檢出率為1%，檢出咽喉/泄殖腔棉拭子陽(yáng)性19份，陽(yáng)性檢出率為2.1%，檢測(cè)結(jié)果相差較大，詳見(jiàn)表3。

表3 不同種類(lèi)樣品禽白血病p27抗原檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

我國(guó)是全球第一大肉雞生產(chǎn)國(guó)，白羽肉雞是主要品種，煙臺(tái)白羽肉雞的市場(chǎng)占有率約為全國(guó)75%。在白羽肉雞產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展的同時(shí)，也面臨著巨大挑戰(zhàn)，疫病流行對(duì)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。白羽肉雞生長(zhǎng)周期短，禽白血病傳隨著代次不斷繁衍，流行和發(fā)病情況日趨嚴(yán)重?？刂圃摬〉闹饕胧┦菍?duì)禽白血病實(shí)施區(qū)域管控，進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，淘汰陽(yáng)性雞只，凈化雞群。由于內(nèi)源性ALV幾乎無(wú)致病性，但會(huì)對(duì)外源性ALV的檢測(cè)和鑒別造成干擾，目前，市場(chǎng)化應(yīng)用最廣泛的抗原試劑盒為美國(guó)IDEXX公司p27抗原試劑盒，還不能有效區(qū)分內(nèi)源性和外源性的感染，所以選擇有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法和方式尤為重要。

本文對(duì)種雞群900份咽喉/泄殖腔棉拭子進(jìn)行ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)，陽(yáng)性20份，陽(yáng)性檢出率為2.2%，對(duì)種雞群900枚雞蛋檢測(cè)，蛋清ALV-p27抗原檢測(cè)出陽(yáng)性9份，陽(yáng)性檢出率為1%，蛋清檢出率遠(yuǎn)低于咽喉/泄殖腔棉拭子。以縣市區(qū)為例，在萊陽(yáng)市、棲霞市、海陽(yáng)市、蓬萊市、招遠(yuǎn)市、牟平區(qū)，蛋清p27抗原ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率低于咽喉/泄殖腔棉拭子檢測(cè)陽(yáng)性率。而在萊州市，蛋清p27抗原檢測(cè)出1份陽(yáng)性，咽喉/泄殖腔棉拭未檢出，可能是存在漏檢；也可能是在采樣環(huán)節(jié)，采集的雞蛋和咽喉/泄殖腔棉拭雖來(lái)自同一雞舍，但不是來(lái)自同一只雞的緣故。在龍口市、開(kāi)發(fā)區(qū)、福山區(qū)，均未檢測(cè)ALV-p27抗原。綜上，禽白血病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)節(jié)中，蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢出率都不相同，且兩者之間的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯的相關(guān)性。

2015年，沈?qū)W懷報(bào)道過(guò)，成年雞以泄殖腔棉拭子作為 ELISA ALV-p27抗原檢測(cè)材料存在假陽(yáng)性結(jié)果。2017年，陳俊霞報(bào)道過(guò)，不同類(lèi)型雞的泄殖腔棉拭子 ALV-p27抗原檢測(cè)法不僅有很高的假陽(yáng)性率，還有一定比例的漏檢率。2018年，黃秀英報(bào)道過(guò)，泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè)不適合作為禽白血病凈化的檢測(cè)指標(biāo)。本文通過(guò)ELISA試驗(yàn)檢測(cè)蛋清、咽喉/泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原，證實(shí)兩者不同的樣品檢出率都不相同，且之間的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯的相關(guān)性，這與之前報(bào)道過(guò)的結(jié)果，具有一致性。在下一步制定種雞場(chǎng)禽白血病凈化路線時(shí)，應(yīng)排除咽喉/泄殖腔棉拭子p27抗原的檢測(cè)方案，不能以泄殖腔棉拭子作為檢測(cè)材料。本試驗(yàn)證實(shí)了咽喉/泄殖腔棉拭子p27 抗原檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用的局限性，為白羽肉雞禽白血病凈化檢測(cè)方案的制定提供參考依據(jù)。