張濤 張勝逆 李靖華 張愛(ài)民 楊季紅 程樹(shù)杰

先天性肛門直腸畸形(anorectal malformations，ARM)是小兒常見(jiàn)的消化道畸形，ARM發(fā)生的病理機(jī)制十分復(fù)雜，許多學(xué)者對(duì)動(dòng)物和人類胚胎肛門直腸正常以及異常的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了研究，目前仍沒(méi)有完全闡明正常肛門直腸胚胎發(fā)育的演變規(guī)律，對(duì)ARM具體的胚胎發(fā)生機(jī)制更是知之甚少［1－3］。胚胎期肛門直腸的形態(tài)演變和構(gòu)型改變依賴于細(xì)胞定向分化、增殖及細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用。前人研究顯示，在小鼠肛門直腸的胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞增殖(凋亡)在泄殖腔分離、肛膜及尿生殖膜崩解中發(fā)揮了重要作用［4，5］。而細(xì)胞增殖(凋亡)是否也參與了人類肛門直腸的發(fā)育，至今未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用3～9周人胚標(biāo)本，結(jié)合PCNA免疫組織化學(xué)及TUNEL技術(shù)染色分析細(xì)胞增殖(凋亡)的時(shí)空分布規(guī)律，初步探討細(xì)胞增殖(凋亡)在肛門直腸胚胎發(fā)育中的作用。旨在更深入地認(rèn)識(shí)肛門直腸胚胎發(fā)育過(guò)程，為進(jìn)一步闡明ARM的發(fā)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑 本研究遵守赫爾辛基宣言，收集因意外妊娠而進(jìn)行人工流產(chǎn)，發(fā)育正常的人胚胎標(biāo)本108例(每例標(biāo)本均取得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)時(shí)間、Carnegie stages人胚胎形態(tài)發(fā)育特征和超聲所測(cè)胎兒頭臀長(zhǎng)、雙頂徑等確定胎齡為3～9周。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液4℃固定12～24 h，常規(guī)脫水制成蠟塊，行矢狀面連續(xù)切片。見(jiàn)表1。

表1 不同胎齡的標(biāo)本分布

1.2 方法 3～5周胚胎取整個(gè)胚胎，6～9周胚胎取其盆部，標(biāo)本經(jīng)0.01 mol/L PBS液沖洗后立即置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定12～24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋。石蠟標(biāo)本進(jìn)行矢狀面連續(xù)切片，厚度4 μm，在顯微鏡下觀察未染色切片，在觀察到泄殖腔或直腸膀胱出現(xiàn)時(shí)連續(xù)保留切片，連續(xù)切片TUNEL和PCNA的免疫組化染色，免疫組化實(shí)驗(yàn)采用SP法。Nikon E800成像系統(tǒng)拍照。采用NIS-Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)連續(xù)對(duì)比觀察不同胎齡人胚的泄殖腔、尿直腸隔、直腸、膀胱和尿道發(fā)育情況及其相互間的關(guān)系。對(duì)TUNEL、PCNA的表達(dá)進(jìn)行定位觀察分析，每張切片分別觀察40倍，100倍及400倍視野圖像，來(lái)判定陽(yáng)性細(xì)胞的分布區(qū)域及大體變化趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 凋亡細(xì)胞觀察 第6周，凋亡細(xì)胞主要位于肛門直腸、尿直腸隔及尿生殖竇的上皮;尤其是在肛門開(kāi)口區(qū)周圍分布著大量凋亡細(xì)胞;第7周，凋亡細(xì)胞大量分布于直腸末端和直腸背側(cè)間質(zhì)區(qū);第8周，直腸及肛管上皮中可以見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，而在尿直腸隔背側(cè)與泄殖腔膜內(nèi)僅觀察到少量的凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖1A～C。

圖1 胚胎6～8周時(shí)，凋亡細(xì)胞在肛門直腸區(qū)的時(shí)空分布特點(diǎn):A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直腸隔;VCM，腹側(cè)泄殖腔膜;R，直腸;U，尿道(TUNEL染色，主圖×40，嵌圖×400)

圖2 胚胎6～8周時(shí)，增殖細(xì)胞在肛門直腸區(qū)的時(shí)空分布特點(diǎn):A，第6周;B，第7周;C，第8周。URS，尿直腸隔;VCM，腹側(cè)泄殖腔膜;R，直腸;U，尿道(PCNA免疫組化染色，主圖×40，嵌圖×400)

2.2 增殖細(xì)胞觀察 第6周，肛門直腸、尿生殖竇及尿直腸隔上可以觀察到微弱的增殖細(xì)胞;散在的增殖細(xì)胞位于背側(cè)泄殖腔膜;第7周，尿直腸隔間質(zhì)中可見(jiàn)增殖細(xì)胞出現(xiàn)，這些細(xì)胞大部分位于肛門直腸和尿直腸隔腹側(cè)的間質(zhì)內(nèi);第8周，增殖細(xì)胞主要分布于尿道和肛門直腸的上皮中，同時(shí)在尿直腸隔與腹側(cè)泄殖腔膜的融合區(qū)域內(nèi)有大量增殖細(xì)胞的聚集。見(jiàn)圖2A～C。

3 討論

ARM是小兒外科常見(jiàn)的先天性消化道畸形，其發(fā)生率1/5 000～1/1 500，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一。其病理類型極其復(fù)雜，從單純的肛門閉鎖到嚴(yán)重的泄殖腔畸形等，給患者帶來(lái)極大的痛苦，引起各國(guó)研究者的高度重視。在本研究中，我們通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察肛門直腸的發(fā)育過(guò)程，提出了一些新觀點(diǎn)，如尿直腸隔與泄殖腔膜的關(guān)系;背側(cè)及腹側(cè)泄殖腔膜分別與肛門直腸和尿生殖竇及會(huì)陰發(fā)育的關(guān)系;細(xì)胞凋亡(增殖)在肛門直腸發(fā)育中的時(shí)空分布特點(diǎn)等。

尿直腸隔與泄殖腔膜在泄殖腔向肛門直腸發(fā)育過(guò)程起到了重要的作用，而尿直腸隔是否與泄殖腔膜融合是目前爭(zhēng)論的焦點(diǎn)之一［4，5］。Van der Putte［6］通過(guò)對(duì)豬和人的胚胎形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn):泄殖腔分隔過(guò)程中，泄殖腔背側(cè)連同其間質(zhì)成份向尾溝移動(dòng)，上皮細(xì)胞和泄殖腔膜向腹側(cè)延伸的同時(shí)，背側(cè)泄殖腔膜逐漸變薄破裂，形成肛門直腸對(duì)外界的開(kāi)口。Kluth等［3］認(rèn)為泄殖腔正常發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生了尿直腸隔這一結(jié)構(gòu)，但未觀察到尿直腸隔與泄殖腔膜的融合，并且強(qiáng)調(diào)在此過(guò)程中泄殖腔構(gòu)型變化的重要性。Paidas等［7］認(rèn)為尿直腸隔與泄殖腔膜的距離的進(jìn)行性減小是泄殖腔構(gòu)型變化的結(jié)果，伴隨著胚胎的生長(zhǎng)、伸展、旋轉(zhuǎn)、尿直腸隔和泄殖腔膜距離不斷減小，未觀察到尿直腸隔和泄殖腔膜的融合。在本研究中，我們注意到肛門直腸的生長(zhǎng)發(fā)育與其毗鄰組織的形態(tài)、空間位置之間存在密切聯(lián)系。本研究顯示胚胎3～5周，尿生殖竇周圍的間質(zhì)與肛門直腸區(qū)間質(zhì)的不對(duì)稱性發(fā)育，泄殖腔發(fā)生位置和構(gòu)象的重大改變;同時(shí)使得尿直腸隔在發(fā)育過(guò)程中不斷接近泄殖腔膜，其間隙變得越來(lái)越狹小。而在胚胎5～7周時(shí)，隨著背側(cè)泄殖腔向尾溝的不斷接近，泄殖腔逐漸縮小;背側(cè)泄殖腔膜在第7周時(shí)崩解，直腸自此與羊膜腔相通，這清楚的表明在人類胚胎肛門直腸發(fā)育過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)尿直腸隔與背側(cè)泄殖腔膜的融合。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，泄殖腔膜腹側(cè)部分較背側(cè)部分明顯為厚，此結(jié)果提示在泄殖腔膜的整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中存在著不均衡性的特點(diǎn)。由此我們推測(cè)，人胚泄殖腔的發(fā)育嚴(yán)格遵循時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律:在早期胚胎發(fā)育中，背側(cè)泄殖腔膜對(duì)于正常肛門直腸的發(fā)育發(fā)生發(fā)揮著極其重要的作用。

此外，在本研究中，還有一個(gè)現(xiàn)象值得密切關(guān)注:在背側(cè)泄殖腔膜崩解后，尿直腸隔進(jìn)一步向頭側(cè)及腹側(cè)移位，向生殖結(jié)節(jié)延展，與腹側(cè)泄殖腔膜融合，直接參與了尿道近-遠(yuǎn)軸的建立，其間質(zhì)參與了會(huì)陰體的形成。值得注意的是，到目前為止，盡管在泌尿生殖道研究領(lǐng)域有研究指出腹側(cè)泄殖腔膜參與了尿道的構(gòu)成，但是均未明確的指出腹側(cè)泄殖腔膜與尿直腸隔的融合這一重要現(xiàn)象［8－10］，使得人們忽視了腹側(cè)泄殖腔膜在參與泌尿生殖道構(gòu)成中所發(fā)揮的作用。這一發(fā)現(xiàn)提示腹側(cè)泄殖腔膜在泌尿生殖道和會(huì)陰的胚胎發(fā)育中具有重要意義，特別是在保持尿道完整性方面發(fā)揮了不可忽視的作用。本研究觀察到的現(xiàn)象對(duì)早期泄殖腔發(fā)育中存在長(zhǎng)久爭(zhēng)議的事件提供了重要的形態(tài)學(xué)證據(jù)，進(jìn)一步說(shuō)明腹側(cè)和背側(cè)泄殖腔膜分別在正常的泌尿生殖系統(tǒng)和直腸發(fā)育中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

肛門直腸形成過(guò)程眾多生物學(xué)事件參與其中，如細(xì)胞分化，增殖，凋亡，轉(zhuǎn)化和粘附。在本研究中，我們首先探討肛門直腸發(fā)育中細(xì)胞凋亡所發(fā)揮的作用。第6周時(shí)，凋亡細(xì)胞主要分布于尿直腸隔背側(cè)間質(zhì)和背側(cè)泄殖腔膜，尿直腸隔間質(zhì)內(nèi)及泄殖腔膜的凋亡細(xì)胞背側(cè)部分比腹側(cè)部分明顯，而此時(shí)正是尿直腸隔頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)的關(guān)鍵時(shí)期，故推測(cè)尿直腸隔背腹側(cè)不均衡的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致尿直腸隔的頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)潛在機(jī)制之一。而尿直腸隔的頭腹側(cè)旋轉(zhuǎn)是泄殖腔構(gòu)型變化重要的一部分，是保證肛門直腸向尾溝下降的關(guān)鍵因素之一。在實(shí)驗(yàn)中，我們同樣觀察到第6周時(shí)(圖4A)，在肛門開(kāi)口區(qū)周圍分布著大量凋亡細(xì)胞，使得肛膜裂解，直腸與外界相通是凋亡作用的結(jié)果，基本與前人的研究［11，12］一致。第7周時(shí)，凋亡細(xì)胞大量分布于直腸末端和直腸背側(cè)間質(zhì)區(qū)，進(jìn)一步證實(shí)在肛門直腸形成過(guò)程中凋亡的重要作用(圖4B)。從第8周，少量的凋亡細(xì)胞分布于尿直腸隔背側(cè)間質(zhì)，這可能與后期的尿直腸隔向頭腹側(cè)進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)密切相關(guān)(圖4C)?？傊?xì)胞凋亡在肛門直腸的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，背側(cè)泄殖腔膜的凋亡與背側(cè)泄殖腔向肛門直腸發(fā)育存在密切的關(guān)系。

細(xì)胞增殖與凋亡相輔相成共同調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)生［11－13］。與 van der Putte［13－15］研究相比較，在本研究中，可以觀察到胚胎6～7周，尿直腸隔腹側(cè)增殖較背側(cè)顯著，促進(jìn)了尿直腸隔向頭腹側(cè)的旋轉(zhuǎn)，泄殖腔膜也因此出現(xiàn)空間位置上從垂直位到水平位的轉(zhuǎn)化，引起了背側(cè)泄殖腔向尾溝的進(jìn)一步接近。到胚胎第8周，增殖細(xì)胞集中出現(xiàn)于尿直腸隔腹側(cè)加快了其向頭腹側(cè)的旋轉(zhuǎn)，促進(jìn)了與腹側(cè)泄殖腔膜的融合。所以我們認(rèn)為:細(xì)胞增殖不但在肛門直腸發(fā)育中發(fā)揮了重大作用，而且對(duì)泌尿生殖道和會(huì)陰的胚胎發(fā)育也有重要的影響。我們推測(cè)，凋亡和增殖雙重作用參與了尾端器官的胚胎發(fā)生，也表明細(xì)胞凋亡和增殖異位分布可能會(huì)干擾正常肛門直腸和泌尿生殖道的發(fā)育。目前認(rèn)為，在肛門直腸形成的關(guān)鍵時(shí)期眾多生物分子參與了細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控，如 Wnt5a［16，17］、Shh 信號(hào)通路［18］、Hoxd-13［19］、Cdx1［20］以及 Tcf4［21］等均在胚胎發(fā)育時(shí)表達(dá)于背側(cè)泄殖腔膜上。在調(diào)控信號(hào)異常表達(dá)的情況下，背側(cè)泄殖腔膜在特定時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡發(fā)生紊亂，導(dǎo)致背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育不良，背側(cè)泄殖腔向尾溝的遷移發(fā)生障礙，從而引發(fā)ARM。

結(jié)合人類肛門直腸胚胎發(fā)育、ARM動(dòng)物模型及臨床ARM的類型，我們綜合分析后提出，胚胎不同階段、泄殖腔及其毗鄰結(jié)構(gòu)的發(fā)育障礙/異常與ARM的嚴(yán)重程度和臨床類型存在一定聯(lián)系。肛門直腸畸形的胚胎發(fā)生和其他畸形的發(fā)生一樣，可能與妊娠期，特別是妊娠早期(4～12周)受到某些致畸因素如病毒感染、化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)等作用有關(guān)。胚胎期發(fā)生障礙的時(shí)間越早，所致畸形的位置越高、越復(fù)雜。若孕期干擾因素出現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期，可能會(huì)出現(xiàn)泄殖腔畸形、尾端發(fā)育不良等嚴(yán)重畸形;在胚胎5～8周時(shí)，背側(cè)泄殖腔膜發(fā)出異常的調(diào)控信號(hào)則可能使背側(cè)泄殖腔向腹側(cè)移位，將引起各型泌尿生殖道瘺，同時(shí)盆底肌發(fā)育缺陷也繼發(fā)出現(xiàn);若干擾因素出現(xiàn)在8周左右，則引發(fā)的畸形會(huì)相對(duì)較輕(肛門狹窄、肛門閉鎖等)。干擾因素出現(xiàn)于8周以后可能使得會(huì)陰及泌尿生殖道發(fā)育障礙，若尿直腸隔與腹側(cè)泄殖腔膜不能融合則可引起URSM畸形;腹側(cè)泄殖腔膜向尿道的延伸異?？赡芤鹉虻老铝训然?。由此我們認(rèn)為，人胚泄殖腔發(fā)育嚴(yán)格遵循著時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律:在早期胚胎發(fā)育中，背側(cè)泄殖腔膜對(duì)于正常肛門直腸的發(fā)育發(fā)生發(fā)揮著極其重要的作用。然而由于孕期干擾因素的出現(xiàn)，胚胎發(fā)育缺陷，干擾了正常的背側(cè)泄殖腔及背側(cè)泄殖腔膜的發(fā)育，背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育異常，背側(cè)泄殖腔構(gòu)象異常，肛門直腸的開(kāi)口位置異常，而異位的后腸開(kāi)口位置的不同可能與背側(cè)泄殖腔膜發(fā)育障礙的程度密切相關(guān)。背側(cè)泄殖腔膜及背側(cè)泄殖腔整體發(fā)育缺陷是ARM出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，背側(cè)泄殖腔膜及背側(cè)泄殖腔的發(fā)育缺陷程度決定了ARM程度。

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