王東彬 黎瑋 楊書文 瞿長(zhǎng)寶 喬娜 蔡文清

·論著·

腎上腺髓質(zhì)素對(duì)腎腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt/eNOS/VEGF信號(hào)通路的作用

王東彬 黎瑋 楊書文 瞿長(zhǎng)寶 喬娜 蔡文清

目的研究腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對(duì)腎腫瘤細(xì)胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路的影響。方法將腎腫瘤細(xì)胞分為對(duì)照組、ADM組、VEGF組，ADM+VEGF受體抑制劑組，ADM+ADM shRNA組,每組設(shè)置24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)間梯度,western-blot檢測(cè)對(duì)照組和ADM組細(xì)胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS、VEGF表達(dá);檢測(cè)VEGF組，ADM+VEGF受體抑制劑組和ADM+ADM shRNA組細(xì)胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS的表達(dá)。結(jié)果PI3K、Akt、eNOS、VEGF在ADM組各時(shí)間梯度組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)(P<0.05)。PI3K、Akt、eNOS在VEGF組和ADM+VEGF受體抑制劑組各時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。PI3K 、Akt 、eNOS在ADM+ ADM shRNA組各時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與其在對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論ADM可激活PI3K/Akt/eNOS/VEGF信號(hào)通路；VEGF受體抑制劑不能阻斷ADM 激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路。ADM一方面通過(guò)VEGF發(fā)揮腎腫瘤血管生成作用，另一方面通過(guò)其受體激活PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路參與腎腫瘤血管生成作用。ADM可能成為抗血管治療腎腫瘤新的靶點(diǎn)。

腎上腺髓質(zhì)素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；腎腫瘤

抗VEGF治療已經(jīng)成為治療進(jìn)展期腎細(xì)胞癌最有效的治療策略,已有多種藥物應(yīng)用于臨床,但部分患者治療效果不滿意，表明在已知治療靶點(diǎn)外，還存在其他血管生成因素。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)有希望成為下一個(gè)抗血管生成治療腎細(xì)胞癌的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槊鞔_ADM在腎細(xì)胞癌血管生成信號(hào)通路的作用以及此作用與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人腎癌786-0細(xì)胞由北京協(xié)和大學(xué)基礎(chǔ)研究所提供。

1.2 主要試劑 ADM純品和山羊抗兔二抗購(gòu)于北京博奧森公司,兔抗人eNOS抗體購(gòu)于美國(guó)ABCam公司。ADMshRNA，VEGF純品，VEGF受體抑制劑，兔抗人Akt抗體，兔抗人PI3K抗體和小鼠抗人VEGF抗體購(gòu)于美國(guó)santa cruz公司，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)干粉購(gòu)于美國(guó)Gibcobrl公司，胎牛血清購(gòu)于北京華美公司，考馬斯亮蘭蛋白定量盒由上海科興生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器 BIX-311二氧化碳培養(yǎng)箱，DG-3A電泳槽，DYY-Ⅲ7B 型轉(zhuǎn)移電泳儀，UVP凝膠成相分析系統(tǒng)。

1.4 分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)良好的786-0細(xì)胞分為對(duì)照組、ADM組(100 μmol/L)、VEGF組(50 μmol/L)、ADM+VEGF受體抑制劑組(ADM:100 μmol/L，VEGF受體抑制劑：100 μmol/L)、ADM+ADM shRNA組(ADM:100 μmol/L，ADM+ADM shRNA：1 μmol/L)。每組設(shè)24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。5組細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳的飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)后收獲細(xì)胞。

1.5 測(cè)定蛋白濃度 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，吸上清至一個(gè)新的清潔EP管中，采用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒，測(cè)定上清液蛋白濃度。

1.6 Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞總蛋白中磷脂酰肌醇(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、VEGF的表達(dá) 每組取20 μg蛋白，裂解液補(bǔ)齊容量，沸水浸泡5 min。大齒梳最多可上50 μl，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)120 V電壓下分離后轉(zhuǎn)膜(PI3K：90 V、60 min；Akt：90 V、50 min；eNOS：120 V、150 min；VEGF：30 V、30 min)。5%脫脂奶粉漿膜封閉2 h后加入一抗(β-actin 1∶1 000，Akt 1∶1 000，PI3K 1∶1 000，eNOS 1∶1 000，VEGF 1∶400)，室溫孵育1.5 h,TBST充分漂洗后加入辣根酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔二抗，抗體稀釋濃度1∶7 500)，孵育1.5 h，TBST再次充分漂洗，最后用ECL顯色試劑顯色。應(yīng)用圖像分析軟件Bandscan(Glyko公司)對(duì)顯色條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 結(jié)果判定 凝膠成像系統(tǒng)(UVP,美國(guó))LabWorks 4.5軟件對(duì)蛋白表達(dá)行半定量分析，以積分吸度(IOD)值表示。

2 結(jié)果

2.1 PI3K在5組腎腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) Western bolt檢測(cè)PI3K在ADM處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。PI3K在ADM+ADM shRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別24h48h72h對(duì)照組0．7987±0．03700．7928±0．04600．7986±0．0629ADM組0．9342±0．0431?1．0328±0．0495?1．3503±0．0503?VEGF組0．8939±0．0922?1．0213±0．0481?1．3890±0．0394?ADM+ADMshRNA組0．7399±0．0530#0．7885±0．06140．8032±0．0593ADM+VEGF受體抑制劑0．9122±0．0860?1．0276±0．0665?1．3466±0．0454?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 AKT在5組腎腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) Western bolt檢測(cè)AKT在ADM處理組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。AKT在ADM+ADM shRNA組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別24h48h72h對(duì)照組0．7461±0．05310．7411±0．07760．7504±0．0724ADM組0．8365±0．0671?0．9729±0．0593?1．0530±0．0432?VEGF組0．8481±0．0661?0．9749±0．0979?1．0433±0．0551?ADM+ADMshRNA組0．7423±0．0748#0．7462±0．07510．7372±0．0715ADM+VEGF受體抑制劑0．8237±0．0452?0．9509±0．0318?1．0352±0．0407?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 eNOS在5組腎腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) Western bolt檢測(cè)eNOS在ADM處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在VEGF處理組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。在ADM+VEGF受體抑制劑組3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。eNOS在ADM+ADM shRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組別24h48h72h對(duì)照組0．8613±0．04420．8692±0．06400．8778±0．0568ADM組1．1875±0．0627?1．3415±0．0583?1．4069±0．0337?VEGF組1．1990±0．0723?1．3371±0．0533?1．4140±0．0598?ADM+ADMshRNA組0．8083±0．07480．8071±0．03660．8288±0．0921ADM+VEGF受體抑制劑1．1880±0．0654?1．3311±0．0503?1．4129±0．0384?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 VEGF在ADM處理組和對(duì)照組中的表達(dá) Western bolt檢測(cè)VEGF在ADM處理組24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對(duì)照組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)(P<0.05)。VEGF在ADM+ADM shRNA組3個(gè)時(shí)間組表達(dá)與對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

組別24h48h72h對(duì)照組0．7647±0．05710．7713±0．06320．7746±0．0512ADM組0．8717±0．0943?1．4345±0．0927?1．7579±0．0721?ADM+ADMshRNA組0．7363±0．07930．7700±0．06780．7856±0．0784

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

腎細(xì)胞癌為典型多血管腫瘤，依賴于腫瘤新生血管生成滿足其生長(zhǎng)和進(jìn)展過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量不斷增加和帶走代謝廢物，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定?？寡苌墒侵委熌I腫瘤有效策略。已經(jīng)有多種抗血管生成藥物應(yīng)用于腎細(xì)胞癌的治療，并且取得令人滿意的效果，這些藥物主要是抗VEGF藥物。ADM和VEGF一樣在人正常組織和腫瘤組織中廣泛表達(dá)[1]，已經(jīng)證實(shí)ADM作為腫瘤細(xì)胞自分泌和旁分泌因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展，還促進(jìn)周圍內(nèi)皮細(xì)胞增殖和改變血管的通透性促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。ADM在腎細(xì)胞癌生成和進(jìn)展方面同樣具有促進(jìn)作用，ADM在體外低氧環(huán)境培養(yǎng)的腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高[3];ADM作用于腎腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá)明顯升高，ADMR shRNA可抑制ADM這一作用[4];ADM和ADMR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯高于其在正常腎組織中表達(dá),并且ADM和ADMR高表達(dá)與腫瘤組織中微血管密度成正相關(guān)性[5]。以上研究表明產(chǎn)生和分泌ADM為腎腫瘤細(xì)胞自身保護(hù)機(jī)制,和腫瘤血管生成有關(guān)。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)大的血管生成誘導(dǎo)劑，通過(guò)激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促腫瘤血管生成，阻斷與VEGF有關(guān)的信號(hào)通路可達(dá)到治療腫瘤的作用。PI3K/AKT/eNOS與腫瘤進(jìn)展 至關(guān)重要，如PI3K/AKT在卵巢上皮癌組織中表達(dá)與腫瘤臨床分期、細(xì)胞組織學(xué)分化有顯著相關(guān)性[6，7]。其在腫瘤血管生成方面的作用也得到共識(shí)，活化的AKT 可使eNOS磷酸化使之激活，產(chǎn)生NO，NO 與血管生成密切相關(guān)[8];PI3K/Akt 還可激活激酶HDM2調(diào)控VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)[9]，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)VEGF 及其他血管生成因子的表達(dá)和分泌；VEGF可反饋性活化PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而進(jìn)一步刺激血管生成;抑制PI3K/AKT/eNOS通路，可抑制VEGF的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移和增加血管通透性的作用[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADM可激活人腎腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/eNOS/VEGF信號(hào)通路；VEGF可激活腎腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/eNOS通路。ADM作用于腎腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá)明顯升高[4]，表明ADM可能通過(guò)影響VEGF發(fā)揮PI3K/AKT/eNOS通路激活作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)VEGF受體抑制劑阻斷VEGF的作用后，ADM仍可激活PI3K/AKT/eNOS通路；而通過(guò)記憶靜默技術(shù)，抑制ADM的作用后，PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路活性受到抑制。表明ADM還可以通過(guò)其受體直接激活PI3K/AKT/eNOS參與腎腫瘤血管生成。

綜上所述，ADM具有腎腫瘤血管生成作用，有助于腎腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，ADM一方面通過(guò)影響VEGF參與腎腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)，同時(shí)ADM還通過(guò)其自身受體，激活PI3K/AKT/eNOS通路，參與血管生成的調(diào)節(jié)。但ADM這一作用尚未在活體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ADM可能成為新的治療腎腫瘤的靶點(diǎn)。

1 Kitamura K,Sakata J,Kangawa K，et al.Cloning and characterization of cDNA encoding a precursor for human adrenomedullin.Biochem Biophys Res Commun,1993,194:720-725.

2 Cuttitta F,Pio R,Garayoa M,et al.Adrenomedullin functions as an important tumor survival factor in human carcinogenesis.Microsc Res Tech,2002,57:110-119.

3 王東彬，黎瑋，楊書文，等.低氧刺激對(duì)腎腫瘤細(xì)胞ADM基因表達(dá)的影響及意義.山東醫(yī)藥，2012，52:59-69.

4 敦雙華，王東彬，喬娜，等.VEGF在腎癌細(xì)胞的表達(dá)及腎上腺髓質(zhì)素對(duì)其影響.山東醫(yī)藥，2012，52：36-37.

5 王東彬，蔡文清，楊樹(shù)文，等.腎上腺髓質(zhì)素在腎腫瘤組織中的表達(dá)及其與腫瘤組織微血管密度的關(guān)系.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011,28：854-856.

6 尚素霜，程佳，張靜，等.卵巢上皮癌中HER-2、TOPO-Ⅱα和PI3K的表達(dá)及臨床意義.河北醫(yī)藥,2012，34:2256-2259.

7 程佳，楊曉龍，尚素霜，等.卵巢上皮性癌組織中磷酸化蛋白激酶B的表達(dá)及意義.河北醫(yī)藥,2013,35:1797-1799.

8 Gordan JD，Simon MC.Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype.Curr Opin Genet Dev，2007，17:71-77．

9 Jiang BH，Liu LI.AKT signaling in regulating angiogenesis.Curr Cancer Drug Targets，2008，8:19-26．

10 Bhattacharya D,Singh MK,Chaudhuri S,et al.T11TS impedes glioma ngiogenesis by inhibiting VEGF signaling and pro-survival I3K/Akt/eNOS pathway with concomitant upregulation of PTEN in brain endothelial cells.J Neurooncol,2013,113:13-25.

EffectoftheadrenomedullinonthesignalingpathwayofPI3K/Akt/eNOS/VEGFinrenaltumorcell

WANGDongbin,LIWei,YANGShuwen,etal.

DepartmentofUrology,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the effect of the adrenomedullin on the signaling pathway of PI3K/Akt/eNOS/VEGF in renal tumor cell.MethodsThe kidney tumor cells were divided into five groups,control group,ADM group,VEGF group,ADM+VEGF receptor inhibitor group,ADM+ADM shRNA group,moreover,every group was redivided three time gradient groups (24 hours,48 hours and 72 hours).The expression levels of PI3K,Akt,eNOS,VEGF in control group and ADM group and the expression levels of PI3K,Akt,eNOS in VEGF group,ADM+VEGF receptor inhibitor group,ADM+ADM shRNA group were detected by Western Blot,respectively.ResultsThe expressions levels of the PI3K,Akt,eNOS,VEGF in ADM groups were significantly higher than those of control group (P<0.05).The expression levels of PI3K,Akt,eNOS in VEGF groups and ADM+VEGF receptor inhibitor groups were significantly higher than those of control group (P<0.05).However there were no significant differences in the expression levels of PI3K,Akt,eNOS between ADM+ ADM shRNA groups and control group (P<0.05).ConclusionADM can activate PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in renal tumor cell,which can not be blocked by VEGF receptor inhibitor.On one hand ADM regulates renal tumor angiogenesis by VEGF,on the other hand,by activating PI3K/Akt/eNOS signaling pathway to participate in renal tumor angiogenesis.ADM may become a promising anti-angiogenic target in the treatment of renal tumor.

adrenomedullin;vascular endothelial growth factor;phosphatidylinositol 3-kinase;protein kinase B;endothelial nitric oxide synthase;renal tumor

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.23.001

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：020130510)；吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)臨床科研專項(xiàng)資助基金(編號(hào)：320.6750.13250)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

R 737.11

A

1002-7386(2014)23-3525-03

2013-11-06)