安旭，董禹釗，楊加周

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室，陜西漢中 716000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌為我國(guó)常見惡性腫瘤以及主要腫瘤死因[1]。根治性手術(shù)為肝癌主要且最有效治療手段，但由于起病隱匿，大多患者確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)療效欠佳[2]。放療和化療雖可一定程度上減少腫瘤細(xì)胞，控制疾病進(jìn)展，但部分患者對(duì)放化療敏感性較低，且可出現(xiàn)耐藥性[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)可致原發(fā)性肝癌大鼠血清抗氧化活性降低，從而使活性氧產(chǎn)物增多，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[4]。隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，臨床逐漸形成了中西醫(yī)結(jié)合的抗腫瘤治療策略，并取得客觀效果。華蟾素是由中華大蟾蜍干燥表皮及其腺體分泌物水溶液制成，具有清熱解毒、消腫止痛效?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，華蟾素具有提高免疫力、抗腫瘤等作用[5]，但其是否具有抗氧化及其對(duì)DEN致大鼠原發(fā)性肝癌抑制作用尚未完全闡明[6-7]。鑒于此，本研究進(jìn)行了相關(guān)分析，旨在為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD大鼠：SPF級(jí)，75只，雌雄各半，平均體質(zhì)量為(162.42±10.54)g，6～9周，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、華蟾素低劑量組、華蟾素中劑量組、華蟾素高劑量組，每組各15只。動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)號(hào)(2020469)。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(貨號(hào)N0258-1G)：美國(guó)Sigma公司，避光保存。華蟾素注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z34020273，規(guī)格5mL*10支，批號(hào)151224.2)：安徽金蟾生化股份有限公司。大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)HZ-0729)、大鼠天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)HZ-0748)、大鼠總膽紅素檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)HZ-47430)：上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。大鼠超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)DRE20008)：上海邦奕生物科技有限公司。大鼠谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)SBJ-R0785)：南京森貝伽生物科技有限公司。大鼠過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)XY-A13557)：上海信裕生物科技有限公司。大鼠丙二醛檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)YS03295B)：上海雅吉生物科技有限公司。酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiskan FC)：美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.3 模型構(gòu)建[8]

采用DEN制備大鼠原發(fā)性肝癌模型。以大豆油配制四氯化碳溶液，經(jīng)模型組、華蟾素低劑量組、華蟾素中劑量組、華蟾素高劑量組大鼠后肢皮下注射，3 mL/kg，2次/周，連續(xù)4周；第5周將飲用水更換為DEN溶液(95 μg/mL)，自由飲用，每日更換，連續(xù)20周?？瞻讓?duì)照組大鼠以等量大豆油皮下注射后，給予普通飲用水。華蟾素低劑量組、華蟾素中劑量組、華蟾素高劑量組大鼠在飲用DEN溶液時(shí)，同時(shí)分別給予華蟾素1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，腹腔注射，1次/日，連續(xù)20周?？瞻讓?duì)照組和模型組大鼠以等體積生理鹽水，腹腔注射，1次/日，連續(xù)20周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1癌變率、肝臟指數(shù)及肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù) 末次給藥24 h，腹腔麻醉后，稱取體質(zhì)量，處死大鼠，取肝臟組織；稱取肝臟組織重量后，計(jì)數(shù)癌變只數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)，癌變率(%)=癌變只數(shù)/總只數(shù)×100%，肝臟指數(shù)(%)=肝臟組織重量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.2瘤重及抑瘤率 末次給藥24 h，腹腔麻醉后，稱取體質(zhì)量；處死大鼠，剝離模型組、華蟾素低劑量組、華蟾素中劑量組、華蟾素高劑量組腫瘤塊，稱取瘤重；抑瘤率(%)=(模型組瘤重-華蟾素干預(yù)組瘤重)/模型組瘤重×100%。

1.4.3血清肝功能指標(biāo)水平 末次給藥24 h，腹腔麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，低溫3 000 r/min離心2 min，取血清；采用酶聯(lián)免疫吸附法，酶標(biāo)儀測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)水平。

1.4.4血清抗氧化活力指標(biāo)水平 取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法，酶標(biāo)儀測(cè)定血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠癌變率、肝臟指數(shù)及肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠癌變率、肝臟指數(shù)和肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，華蟾素處理大鼠癌變率、肝臟指數(shù)和肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)。表1，圖1。

表1 各組大鼠癌變率、肝臟指數(shù)及肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)比較

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2.2 各組大鼠瘤重和抑瘤率比較

與模型組比較，華蟾素處理大鼠瘤重顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)；抑瘤率隨華蟾素劑量增加而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表2。

表2 各組大鼠瘤重和抑瘤率比較

2.3 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，華蟾素處理大鼠血清ALT、AST和TBIL水平顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)。表3

表3 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)水平比較

2.4 各組大鼠血清抗氧化活力指標(biāo)水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性顯著降低，MDA活性顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，華蟾素處理大鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性顯著升高，MDA活性顯著降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)。表4

表4 各組大鼠血清抗氧化活力指標(biāo)水平比較

3 討 論

基于中國(guó)腫瘤登記年報(bào)等多個(gè)國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)源，發(fā)現(xiàn)總體上，我國(guó)肝癌發(fā)病率和死亡率仍處于較高水平，人群疾病負(fù)擔(dān)重[9]。根治性手術(shù)可明顯改善肝癌患者預(yù)后，但術(shù)后5年生存率僅約50%[10]，且術(shù)后5年復(fù)發(fā)率達(dá)60%～70%[11]。放化療為除手術(shù)治療外，肝癌重要輔助治療手段[12]。但研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者對(duì)放化療敏感性不高，應(yīng)用受到限制[13]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，中藥在惡性腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。中醫(yī)學(xué)中，肝癌屬“肝積”、“黃疸”、“血證”等范疇，其中肝郁氣滯為該病基本病機(jī)[14]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載，“蟾蜍味辛寒，主邪氣，破癌堅(jiān)血、癰腫、陰瘡，服之不患熱病”。表明蟾蜍在治療惡性腫瘤上具有重要價(jià)值。華蟾素為干蟾皮提取物，其活性成分主要以華蟾素精、蟾毒它靈等蟾毒內(nèi)酯類物質(zhì)為主，具有清熱解毒、消腫止痛、祛瘀散結(jié)功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素在抗腫瘤方面亦具有重要作用[15]。

高波等[16]研究發(fā)現(xiàn)，無論體外還是體內(nèi)，華蟾素均具有明顯的抑瘤作用。王培培等[17]研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素對(duì)H22肝癌小鼠有顯著抑瘤作用，并可顯著增強(qiáng)小鼠免疫力，增強(qiáng)順鉑化療效果。本研究亦得出，華蟾素對(duì)DEN致原發(fā)性肝癌大鼠有顯著的抑瘤作用，其強(qiáng)度具有劑量依賴性，符合以往研究結(jié)果。同時(shí)通過檢測(cè)小鼠肝功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，華蟾素對(duì)DEN致原發(fā)性肝癌大鼠肝功能具有明顯改善作用，可能與其提高機(jī)體及細(xì)胞免疫功能有關(guān)[18]。ROS增多可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，參與多種惡性腫瘤發(fā)病[19]。研究表明，通過降低細(xì)胞內(nèi)氧化活性，可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[20]。本研究結(jié)果顯示，華蟾素可顯著降低DEN致原發(fā)性肝癌大鼠血清MDA活性，提高SOD、GSH-Px和CAT活性，其強(qiáng)度具有劑量依賴性，表明華蟾素可能通過提高DEN致原發(fā)性肝癌大鼠肝組織抗氧化活力，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，華蟾素可能通過提高DEN致原發(fā)性肝癌大鼠肝組織抗氧化活力，發(fā)揮抗腫瘤作用。