林育輝,周蕾,戴文軍,黃炯華,何曉青

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510150)

高血壓、缺血性心臟病、心臟瓣膜病等多種心臟疾病均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。心肌肥大是心血管疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)的一種獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。腦鈉肽(brain natriμretic peptide，BNP)是一種具有生物活性多肽類物質(zhì)，具有排出水鈉的作用，主要由心肌細(xì)胞合成，特別是在心力衰竭時(shí)其分泌量明顯增加。除了作為心衰標(biāo)志物，BNP也是心肌肥大標(biāo)志物之一，不僅反映左室收縮舒張功能障礙，也反映心肌肥大的情況。葛根素化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7-二羥基異黃酮，是從野生豆科匍匐莖葛根中分離出的主要異黃酮，具有多種藥理活性，已用于治療心肌梗死、高血壓、心絞痛等心血管疾病[1]。本研究采用內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)誘導(dǎo)人源心肌細(xì)胞肥大模型，結(jié)合高內(nèi)涵檢測(cè)技術(shù)，旨在探討葛根素能否通過降低BNP表達(dá)量，起到保護(hù)肥大心肌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

hiPSC誘導(dǎo)分化的人源心肌細(xì)胞(北京賽貝生物技術(shù)有限公司)、心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(北京賽貝生物技術(shù)有限公司)、ET-1(美國(guó)Sigma公司)、葛根素(浙江震元制藥有限公司)、Matrigel(美國(guó)BD公司)、Anti Cardiac Troponin T抗體(美國(guó)abcam公司)、Anti BNP抗體(美國(guó)abcam公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高內(nèi)涵儀器ImageXpress Nano(美國(guó)Molecμlar Devices公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與造模 Matrigel預(yù)包被96孔板，37 ℃放置30 min；復(fù)蘇hiPS-CMs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h；換液前將培養(yǎng)基水浴至37 ℃，吸取50 μL，棄去，加入100 μL心肌細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h；顯微鏡下觀察細(xì)胞處于正常跳動(dòng)狀態(tài)后，全部更換心肌細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔150 μL；細(xì)胞處理前6 h，更換培養(yǎng)基，每孔135 μL；葛根素使用培養(yǎng)基稀釋為10×儲(chǔ)備液，每孔加入15 μL，終濃度為200 μg /mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h；葛根素使用培養(yǎng)基稀釋為1×工作液，采用此工作液配置10×ET-1儲(chǔ)備液作為處理組，采用心肌細(xì)胞培養(yǎng)基配置10× ET-1儲(chǔ)備液作為造模組，吸棄各孔中15 μL培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入藥物處理各孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 分為5組：正常細(xì)胞組(CTL)：hIPSC-CMs不進(jìn)行特殊處理；肥大心肌細(xì)胞組(ET-1)：10 nmol/L ET-1處理24 h ，以誘導(dǎo)hIPSC-CMs肥大；葛根素組(PI)：200 μg/mL葛根素處理 hIPSC-CMs 12 h；葛根素后處理組(ET-1+PI)：10 nmol/L ET-1誘導(dǎo)心肌肥大后，再加入葛根素200 μg/mL處理12 h；葛根素預(yù)處理組(PI+ET-1)：10 nmol/L ET-1誘導(dǎo)心肌肥大前，葛根素200 μg/mL預(yù)處理12 h。

1.3.3高內(nèi)涵技術(shù)檢測(cè) 棄去培養(yǎng)基，每孔150 μL預(yù)熱PBS洗滌3遍；每孔50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄去，PBS洗滌3遍；加入0.3% Triton-X 50 μL室溫30 min，棄去，PBS洗滌3遍；加入5% BSA 50 μL置于振蕩器上輕搖，室溫封閉1 h，PBS洗滌3遍。1% BSA分別稀釋一抗(BNP、TNNT2)1∶200，每孔加入50 μL，4 ℃過夜，第二天棄去，PBS洗滌3遍；加入1% BSA稀釋二抗(1∶500)，每孔50 μL，置于振蕩器上輕搖，室溫避光孵育2 h，棄去，PBS洗滌3遍；加入PBS配置的Hoechst 33258(濃度10 μg/mL)，每孔50 μL，置于振蕩器上輕搖，室溫30 min，棄去，PBS洗滌3遍；加入PBS，每孔100 μL。

采用MD ImageXpress Nano高內(nèi)涵儀器采集并分析數(shù)據(jù)。以DAPI通道(Hochest 33258，細(xì)胞核陽性)、FITC通道(TNNT2，心肌細(xì)胞陽性)為識(shí)別對(duì)象，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)每個(gè)對(duì)象中Cy3通道(BNP)熒光強(qiáng)度，其平均值記為熒光強(qiáng)度，反映BNP表達(dá)量。DAPI為細(xì)胞核染色，各組心肌細(xì)胞胞核在熒光顯微鏡下可呈藍(lán)色熒光，且TNNT2均為陽性反應(yīng)，呈綠色熒光；而BNP呈紅色熒光，Merge為合成圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

各組免疫熒光染色圖像見圖1。各組高內(nèi)涵熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析見圖2。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，ET-1處理心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞肥大導(dǎo)致BNP的表達(dá)量增加。與ET-1組相比，各組BNP表達(dá)量均減少(P< 0.05)，其中PI+ET-1組、ET-1+PI組BNP表達(dá)量較ET-1組明顯下降(P< 0.05)，這說明葛根素的預(yù)處理及后處理均可降低肥大心肌細(xì)胞BNP的表達(dá)量，其中葛根素預(yù)處理組(PI+ET-1組)下降更為明顯(P< 0.05)。

CTLPIET1PI+ET-1ET-1+PI

250200150100500Intensity**********CTLPIET-1PI+ET-1ET-1+PIGroups

3 討 論

心肌肥大是心肌細(xì)胞對(duì)壓力超負(fù)荷及神經(jīng)內(nèi)分泌因子等刺激因素所做出的代償性反應(yīng)。多種心血管疾病可導(dǎo)致心肌肥大，包括高血壓、心臟瓣膜病、肥厚性心肌病、冠心病等[2]。從細(xì)胞水平來說，肥大刺激信號(hào)與心肌細(xì)胞上的特定受體或者膜通道結(jié)合，經(jīng)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)，可將刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，引起基因轉(zhuǎn)錄的改變及蛋白表達(dá)的變化，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大的表型及功能障礙等一系列病理變化[3]。若肥大刺激因素不消除，肥大心肌細(xì)胞會(huì)從代償向失代償轉(zhuǎn)變，最后進(jìn)入心力衰竭階段[4]。β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等在臨床上雖然取得一定的療效，但其應(yīng)用仍有很大的局限性。尋找有效治療心肌肥大的藥物，對(duì)于降低此類患者的住院率及死亡率具有十分重要的意義。

ET-1是由平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞等合成及分泌的一種含有21個(gè)氨基酸的活性多肽；主要以旁分泌的形式作用于細(xì)胞表面的ET受體[5]。ET受體是G蛋白偶聯(lián)受體，ET-1與位于細(xì)胞膜上的ET受體結(jié)合后，除了起著強(qiáng)效縮血管效應(yīng)，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)也起著重要的作用。局部組織中ET-1過表達(dá)與心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可通過激活PKC、MAPK、Ca2+等多條信號(hào)通路介導(dǎo)心肌肥大的病理生理過程[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，模擬人體病理狀態(tài)下心肌局部ET-1濃度升高的病理過程。這種肥大心肌細(xì)胞模型較為接近機(jī)體心肌肥大的病理狀態(tài)，是藥物試驗(yàn)的理想模型工具。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證實(shí)ET-1可誘導(dǎo)人源心肌細(xì)胞肥大，成功制作肥大心肌細(xì)胞模型[8]。

葛根素是從豆科植物野葛根中提取的一種單一成分黃酮苷[9]，具有多種藥理特性，包括降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)、改善心肌細(xì)胞代謝、抑制動(dòng)脈硬化、抗心律失常及β受體阻滯和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制等作用[1]。已有研究結(jié)果證實(shí)，葛根素能抑制心肌肥大[10]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素對(duì)于心肌細(xì)胞安全的血液濃度范圍較大，200 μg/mL為臨床報(bào)道4 h血藥濃度的10倍，該濃度下沒有表現(xiàn)出對(duì)hiPS-CMs的細(xì)胞毒性和心肌毒性，故本研究將該濃度定為研究葛根素對(duì)心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的作用濃度[8]。

BNP是由心肌細(xì)胞合成的，具有生物學(xué)活性的天然激素，其合成分泌的主要部位是心室，同時(shí)也存在于腦組織中。多種因素可影響B(tài)NP的釋放，容量負(fù)荷引起的心室壓力改變及室壁張力的增加可有效刺激BNP的釋放[11]。機(jī)體健康狀態(tài)下，BNP的表達(dá)量很少，但在心肌肥大或心力衰竭時(shí)，BNP的表達(dá)量會(huì)明顯增加[12]。

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，ET-1可以促進(jìn)心臟合成、分泌BNP。ET-1與位于細(xì)胞膜上的ET受體結(jié)合后，通過PKC、MAPK、Ca2+等信號(hào)通路，增加轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化調(diào)節(jié)基因的表達(dá),促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，包括α-actinin、BNP等多種蛋白表達(dá)增加。ET-1促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌BNP的具體機(jī)制如下：ET-1與心肌細(xì)胞上的ET受體相結(jié)合，通過上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞內(nèi)Fos、Jμn、Egr-1、c-myc表達(dá)水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致BNP的合成及分泌增加[6,13-14]。當(dāng)然，ET-1促進(jìn)BNP表達(dá)增加是否還有其他信號(hào)通路的參與，哪條信號(hào)通路起著最主要的作用，仍有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

高內(nèi)涵檢測(cè)技術(shù)可通過高分辨率的熒光成像系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行快速、靈敏、多參數(shù)的細(xì)胞生物學(xué)信息采集，并可通過相應(yīng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其最大優(yōu)點(diǎn)就是能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整及功能相對(duì)正常的情況下，多靶點(diǎn)多通道檢測(cè)活細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)功能[15]。對(duì)于心肌細(xì)胞這種貼壁細(xì)胞，HSC技術(shù)的自動(dòng)顯微成像技術(shù)與圖像分析技術(shù)相結(jié)合，可對(duì)貼壁心肌細(xì)胞多個(gè)細(xì)胞成分進(jìn)行多靶點(diǎn)檢測(cè)，具有速度快、準(zhǔn)確率高并且可以量化的優(yōu)勢(shì)。

本研究采用96孔板接種人源心肌細(xì)胞，并用ET-1誘導(dǎo)肥大，以DAPI通道(細(xì)胞核陽性)、FITC通道(TNNT2，心肌細(xì)胞陽性)為識(shí)別對(duì)象，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)每個(gè)對(duì)象中Cy3通道(BNP)熒光強(qiáng)度，其平均值記為熒光強(qiáng)度，反映BNP表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ET-1誘導(dǎo)hIPSC-CMs肥大后，BNP表達(dá)量明顯增加；葛根素預(yù)處理或后處理，均可降低肥大心肌細(xì)胞BNP的表達(dá)量。本研究中采用的高內(nèi)涵檢測(cè)技術(shù)從圖像掃描到數(shù)據(jù)分析時(shí)間控制在2 h以內(nèi)，與傳統(tǒng)的免疫組化方法相比較，實(shí)驗(yàn)時(shí)間明顯減少、實(shí)驗(yàn)效率顯著提高。另外，本實(shí)驗(yàn)采用人源性心肌細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞，這種人源心肌細(xì)胞與人體原有心肌細(xì)胞無論在基因序列，還是在細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能上保持高度一致，并具有自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng)功能，在探索研究某些藥物對(duì)人心肌細(xì)胞的功效、毒性及作用機(jī)制方面具有重要的意義，實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果更接近臨床實(shí)際。