李一 黃婷 楊麟瀚 吳池華

[摘要] 目的 探討膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2（MAGI2）對(duì)乳癌耐藥細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

方法 采用熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)MAGI2在人乳癌細(xì)胞MCF-7與阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中的表達(dá)量。在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下將siRNA NC、siRNA MAGI2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MCF-7/ADR細(xì)胞。以細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)MAGI2、磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與MCF-7細(xì)胞相比，MAGI2在MCF-7/ADR細(xì)胞中表達(dá)量明顯增加（t=19.902，P<0.05）。si-MAGI2可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡（t=4.027～24.651，P<0.05），降低p-PI3K、p-AKT蛋白水平（t=18.266、19.117，P<0.05）。

結(jié)論 MAGI2可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。

[關(guān)鍵詞] MAGI2;乳癌耐藥細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;PI3K/AKT信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R737.9;R345.57

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）03-0369-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.064

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210201.1054.003.html;2021-02-01 15：58：41

EFFECT OF MAGI2 GENE SILENCING ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF DRUG-RESISTANT BREAST CANCER CELLS

LI Yi， HUANG Ting， YANG Linhan， WU Chihua

（Department of Breast Surgery， Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial Peoples Hospital， Chengdu 610072， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of membrane-associated guanylate kinase 2 （MAGI2） on the proliferation and apoptosis of drug-resistant breast cancer cells.

Methods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of MAGI2 in human breast cancer MCF-7 cells and adriamycin-resistant MCF-7/ADR cells. The siRNA NC and siRNA MAGI2 plasmids were transfected into MCF-7/ADR cells under the mediation of Lipofectamine 2000. CCK-8 assay was used to observe cell proliferation， and flow cytometry was used to measure cell apoptosis. Western blot was used to measure the protein expression of MAGI2 and the proteins involved in the PI3K/AKT signaling pathway.

Results Compared with MCF-7 cells， MCF-7/ADR cells had a significant increase in the expression of MAGI2 （t=19.902，P<0.05）. The si-MAGI2 inhibited the proliferation of MCF-7/ADR cells， promoted the apoptosis of these cells （t=4.027-24.651，P<0.05）， and reduced the levels of phosphorylated PI3K and AKT protein （t=18.266，19.117;P<0.05）.

Conclusion MAGI2 may promote the proliferation and inhibit the apoptosis of MCF-7/ADR cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway.

[KEY WORDS]MAGI2; breast cancer drug-resistant cells; cell proliferation; cell apoptosis; PI3K/AKT signaling pathway

乳癌是女性腫瘤中死亡率較高的癌癥之一，目前臨床上常采用手術(shù)切除、放化療等治療手段，但是仍會(huì)出現(xiàn)治療效果不佳、復(fù)發(fā)等不良情況[1-2]。阿霉素是化療常用的治療藥物之一，在化療過(guò)程中容易產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響病人的治療效果[3-6]。研究結(jié)果顯示，膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白2（MAGI2）可通過(guò)結(jié)合于第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等[7]。MAGI2被證實(shí)在乳癌細(xì)胞中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但對(duì)乳癌耐藥細(xì)胞的研究相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)MAGI2在人乳癌細(xì)胞MCF-7及阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中的表達(dá)量，并通過(guò)小干擾RNA（siRNA）下調(diào)其 MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)量，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為提高乳癌耐藥細(xì)胞的分子靶向治療效果提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)自日本DOJINDO公司;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，siRNA NC質(zhì)粒、siRNA MAGI2質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，兔抗MAGI2、兔抗磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、兔抗絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）抗體、兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K）、兔抗磷酸化AKT（p-AKT）、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7及MCF-7/ADR細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中孵育，加入體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清。為維持MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥性，額外在培養(yǎng)基中加入75 mg/L阿霉素。培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃，每2 d更換1次培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶按1∶3比例傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期的MCF-7/ADR細(xì)胞，將其隨機(jī)分為si-NC組、si-MAGI2組。si-NC組和si-MAGI2組根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書將siRNA NC質(zhì)粒和siRNA MAGI2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入MCF-7/ADR細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 qPCR實(shí)驗(yàn) 按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞的總RNA，并檢測(cè)其濃度和純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參照，通過(guò)Bio-Rad PCR系統(tǒng)分析MAGI2的表達(dá)水平。所用引物及其序列見表1。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集1×105個(gè)MCF-7/ADR細(xì)胞，根據(jù)1.2.2的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h，接種至96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL的CCK-8工作液，孵育2～3 h，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值（A值）。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn) 收集MCF-7/ADR細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含10 g/L的PMSF），4 ℃孵育30 min，提取細(xì)胞總蛋白，與適量緩沖液混勻，100 ℃變性10 min。吸取20 μg蛋白依次加入上樣孔，通過(guò)100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放置50 g/L封閉液孵育1 h，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至裝有加入MAGI2抗體（1∶1 000）、PI3K（1∶2 000）、AKT（1∶10 000）、p-PI3K（1∶5 000）、p-AKT（1∶1 000）溶液中，4 ℃過(guò)夜，加入二抗（1∶5 000）孵育60 min，顯影、曝光，比較MAGI2和GAPDH蛋白灰度值比值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 收集MCF-7/ADR細(xì)胞，加200 μL 磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC/碘化丙啶工作液，37 ℃孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)? 果

2.1 MAGI2在MCF-7及MCF-7/ADR細(xì)胞表達(dá)

MAGI2在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)量分別為1.000±0.075和2.136±0.118。與MCF-7細(xì)胞相比，MAGI2在MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá)量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.902，P<0.05）。見圖1。

2.2 沉默MAGI2對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞MAGI2蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖影響

與si-NC組相比，si-MAGI2組MCF-7/ADR細(xì)胞中MAGI2蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有顯著性（t=20.175，P<0.05）;si-MAGI2組MCF-7/ADR細(xì)胞增殖明顯抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.129～6.167，P<0.05）。見圖2、表2。

2.3 沉默MAGI2對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡影響

si-NC組和si-MAGI2組MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡率分別為（5.236±0.479）%和（27.423±2.152）%。與si-NC組相比，沉默MAGI2可促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.651，P<0.05）。

2.4 沉默MAGI2對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

結(jié)果顯示，與si-NC組相比，沉默MAGI2對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中總PI3K蛋白水平及總AKT蛋白水平均無(wú)明顯影響，但可明顯降低p-PI3K蛋白和p-AKT蛋白的表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.266、19.117，P<0.05）。見圖3、表3。

3 討? 論

乳癌是一種女性常見惡性腫瘤[8-9]。化療是一種常用的乳癌治療手段，其中阿霉素是臨床常用的化療藥物[10-11]。MAGI2是膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族的成員之一，含有1 227個(gè)氨基酸殘基，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，能夠與相應(yīng)的配體結(jié)合從而參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程。近年來(lái)的研究證實(shí)，MAGI2參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。例如，MAGI2在胰腺癌組織中表達(dá)量異常，與臨床病理特征如分期、復(fù)發(fā)等相關(guān)[12]。有研究表明，MAGI2可作為miR-487a的靶基因參與乳癌細(xì)胞的侵襲、遷移、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程，在乳癌組織生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13]，這說(shuō)明MAGI2可以作為乳癌臨床診斷的潛在標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，MAGI2蛋白在MCF-7/ADR細(xì)胞中較MCF-7表達(dá)量上調(diào)，而下調(diào)MAGI2蛋白表達(dá)水平可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，表明MAGI2可通過(guò)促進(jìn)乳癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，增強(qiáng)其阿霉素耐藥性。

研究表明，MAGI2含有與PTEN蛋白具有高親和力的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)特異性募集、結(jié)合于PTEN，促進(jìn)PTEN蛋白的穩(wěn)定性表達(dá)[7]，PTEN可參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，例如前列腺癌、口腔癌、乳癌等[14-16]。PTEN主要通過(guò)影響PI3K/AKT等信號(hào)通路的活性，參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性[17-20]。研究顯示，PI3K/AKT可以參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等[21-22]，影響多種腫瘤的病理進(jìn)展過(guò)程，如卵巢癌、結(jié)腸癌、乳癌等[23-24]，與乳癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的耐藥性密切相關(guān)[25-28]。LI等[25]研究結(jié)果顯示，si-HOTAIR通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)降低乳癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的抗性。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)MAGI2對(duì)總的PI3K蛋白、AKT蛋白水平均無(wú)顯著的影響，但可明顯降低p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白水平，表明下調(diào)MAGI2可能是通過(guò)特異性結(jié)合于PTEN，進(jìn)而影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活化水平，從而調(diào)控乳癌細(xì)胞的耐藥性。

綜上所述，MAGI2基因在乳癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中表達(dá)量增加;下調(diào)MAGI2基因可能通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活性水平，從而抑制耐藥細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，這為耐藥細(xì)胞的分子靶向治療提供理論依據(jù)。未來(lái)會(huì)進(jìn)一步在多株耐藥細(xì)胞系、動(dòng)物模型以及臨床樣本中進(jìn)一步探究MAGI2調(diào)控乳癌細(xì)胞耐藥性的作用以及機(jī)制。

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（本文編輯 于國(guó)藝）