弭苗苗 姜慧慧 魏曉楠 劉杰 辛鈺 孫成銘

[摘要] 目的 基于生物信息學(xué)技術(shù)，篩選與雌激素受體（ER）陽性乳癌相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA），并初步探討其與病人預(yù)后的關(guān)系。

方法 通過基因芯片技術(shù)，對4對手術(shù)切除的ER陽性乳癌組織及其癌旁正常組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)譜分析，并對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO功能注釋、KEGG通路富集分析及疾病富集分析;應(yīng)用qRT-PCR方法對差異表達(dá)的lncRNA在40對ER陽性乳癌組織及癌旁組織中進(jìn)行驗證，同時在ER陽性乳癌細(xì)胞株MCF-7及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A做進(jìn)一步驗證;最后通過TCGA數(shù)據(jù)庫對lncRNA在ER陽性乳癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分組，使用Kaplan-Meier生存曲線分析其表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)果 基因芯片技術(shù)分析顯示，在ER陽性乳癌組織及其癌旁正常組織共篩選出具有差異性表達(dá)的mRNA 3 949個、lncRNA 4 050個。選取其中差異表達(dá)最顯著的7個lncRNA在組織中做進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)LINC01614（t=10.380，P<0.01）、AC044784.1（t=3.490，P<0.01）、CTD-2510F5.4（t=3.235，P<0.01）在乳癌組織高表達(dá);細(xì)胞學(xué)驗證結(jié)果顯示，LINC01614（t=3.714，P<0.05）、AC044784.1（t=5.827，P<0.01）、CTD-2510F5.4（t=4.415，P<0.05）在乳癌細(xì)胞株中同樣高表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)后分析顯示，納入的791例ER陽性乳癌病人中，LINC01614高表達(dá)者預(yù)后相對更差（χ2=7.50，P<0.01）。

結(jié)論 LINC01614在ER陽性乳癌中高表達(dá)可能與乳癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，可能成為乳癌治療新的作用靶點。

[關(guān)鍵詞] 乳房腫瘤;RNA，長鏈非編碼;寡核苷酸序列分析;計算生物學(xué);受體，雌激素;預(yù)后

[中圖分類號] R737.9;R394-33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）03-0333-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.123

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1618.005.html;2021-06-29 09：41：39

DIFFERENTIAL EXPRESSION OF LONG NON-CODING RNAS IN ESTROGEN RECEPTOR-POSITIVE BREAST CANCER

MI Miaomiao， JIANG Huihui， WEI Xiaonan，LIU Jie，? XIN Yu， SUN Chengming

（Center for Laboratory Diagnosis， Yantai Yuhuangding Hospital Affiliated to Qingdao University， Yantai 264000， China）

[ABSTRACT]Objective To screen out the long non-coding RNAs （lncRNAs） associated with estrogen receptor （ER）-positive breast cancer based on bioinformatics technology， and to investigate their association with patient prognosis.

Methods The gene microarray technique was used to analyze the expression profiles of lncRNAs and mRNAs in four pairs of surgically resected ER-positive breast cancer tissue samples and adjacent tissue samples， and GO functional annotation， KEGG pathway enrichment analysis， and disease enrichment analysis were performed for differentially expressed mRNAs. The qRT-PCR method was used to verify the differentially expressed lncRNAs in 40 pairs of ER-positive breast cancer tissue samples and adjacent tissue samples， and further verification was performed in the ER-positive breast cancer cell line MCF-7 and the normal breast epithelial cell line MCF-10A. The Cancer Genome Atlas （TCGA） database was used for grouping based on the expression level of lncRNAs in ER-positive breast cancer tissue， and the Kaplan-Meier survival curve was used to investigate the association of expression level with prognosis.

Results The gene microarray analysis showed that a total of 3 949 differentially expressed mRNAs and 4 050 differentially expressed lncRNAs were screened out between ER-positive breast cancer tissue and adjacent tissue. Further verification of the 7 lncRNAs with strongest differential expression showed that LINC01614 （t=10.380，P<0.01）， AC044784.1 （t=3.490，P<0.01）， and CTD-2510F5.4 （t=3.235，P<0.01） were highly expressed in breast cancer tissue， and cytological verification showed that LINC01614 （t=3.714，P<0.05）， AC044784.1 （t=5.827，P<0.01）， and CTD-2510F5.4 （t=4.415，P<0.05） were also highly expressed in the breast cancer cell line. The prognostic analysis based on TCGA database showed that among the 791 patients with ER-positive breast cancer， there was significant difference in the patients with high expression of LINC01614 tended to have poor prognosis （χ2=7.50，P<0.01）.

Conclusion High expression of LINC01614 in ER-positive breast cancer may be associated with

the development， progression， and prognosis of breast cancer， and therefore， it may become a new target for targeted breast cancer therapy.

[KEY WORDS]breast neoplasms; RNA， long noncoding; oligonucleotide array sequence analysis; computational biology; receptors， estrogen; prognosis

乳癌是目前導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。根據(jù)雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體（HER2）的表達(dá)，乳癌被分為不同的亞型[3]，其中ER陽性乳癌約占75%。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種轉(zhuǎn)錄本長度> 200個核苷酸的非編碼RNA[4-5]。已有多項研究結(jié)果表明，lncRNA在多種癌癥的發(fā)展和進(jìn)程中起著重要的作用[6-8]。但目前關(guān)于ER陽性乳癌中l(wèi)ncRNA的生物學(xué)作用和功能卻鮮見報道。本研究通過基因芯片技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合方法，篩選影響ER陽性乳癌預(yù)后的lncRNA，并初步探討其可能的作用機(jī)制，以期為ER陽性乳癌的診斷、治療提供參考。 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

2019年12月—2020年10月，選擇在青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院乳腺外科確診并行乳癌切除術(shù)病人40例，均為女性，年齡33～70歲，平均（57.0±8.7）歲。符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前快速穿刺病理結(jié)果為浸潤性乳癌;②術(shù)前均未接受放療、化療等針對腫瘤的治療;③術(shù)中切除乳癌組織病理免疫組化結(jié)果示ER陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他惡性腫瘤病史病人;②病理資料不完善者;③具有免疫系統(tǒng)疾病或高血壓等全身疾病等病史病人。術(shù)中留取200～300 mg乳癌組織和距病灶邊緣≥5 cm的癌旁正常組織，放入凍存管后置于液氮中保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 基因芯片表達(dá)譜的構(gòu)建及差異基因的篩選

在40例ER陽性乳癌標(biāo)本中選取4對癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本，應(yīng)用CapitalBio Technology Human LncRNA Arrayv4，4×80 K基因芯片（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供），分別檢測lncRNA及mRNA的差異性表達(dá);4例均為女性、絕經(jīng)后、單側(cè)發(fā)病乳癌病人，術(shù)后病理為浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ級，免疫組化結(jié)果提示ER陽性率>80%、Ki-67陽性率≥14%，臨床確診為Luminal B型乳癌。使用Trizol方法（Invitrogen，USA）從4對樣本中提取總RNA，應(yīng)用NucleoSpin RNA clean-up試劑盒（MACHEREY-NAGEL，德國）進(jìn)行純化，用Nanodrop定量檢測純化后總RNA的濃度及純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用First Strand Enzyme Mix合成First strand cDNA，再用Second Strand Enzyme Mix將其轉(zhuǎn)化為Second Strand cDNA，通過CbcScriptⅡ酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行純化，最后以Random Primer為引物，用Klenow Fragment酶合成cDNA互補(bǔ)鏈并摻入帶有熒光基團(tuán)的dNTP，再次純化后定量標(biāo)記產(chǎn)物用于芯片雜交，標(biāo)記過程采用晶芯生物芯片通用標(biāo)記試劑盒。用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件對雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析，以差異倍數(shù)FC≥2、P<0.05為顯著差異表達(dá)的lncRNA及mRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)。lncRNA及mRNA的參考數(shù)據(jù)庫主要為Ensemble數(shù)據(jù)庫。

1.3 差異聚類分析

通過對4對乳癌病人的癌組織及其癌旁正常組織進(jìn)行基因芯片檢測，對具有差異表達(dá)的lncRNA及mRNA進(jìn)行監(jiān)督聚類分析，以展示不同組織樣本中所測基因的表達(dá)情況;通過監(jiān)督聚類分析反映樣本和基因間的相似性，觀察各組織樣本的表達(dá)模式相關(guān)性及離群樣本的存在情況。

1.4 基因注釋富集分析

對于通過基因芯片技術(shù)檢測到的mRNA中差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO、KEGG通路富集分析及疾病注釋富集分析。GO富集分析又分為細(xì)胞學(xué)組件、生物學(xué)途徑、分子功能3個部分，對篩選出的具有差異表達(dá)的mRNA通過富集分析，預(yù)測其在乳癌疾病發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用途徑。

1.5 lncRNA與mRNA的共表達(dá)分析

共表達(dá)分析是以相關(guān)性為基礎(chǔ)，從基因表達(dá)層面尋找表達(dá)譜相似的lncRNA-mRNA關(guān)系對。其方法為以各個探針在各個樣品中的標(biāo)準(zhǔn)化后信號值作為數(shù)據(jù)源進(jìn)行兩兩相關(guān)性計算和假設(shè)驗證，采用Pearson相關(guān)性分析計算相關(guān)系數(shù)（r）和P值。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：r>0.99或<-0.99，且P<0.05。

1.6 qRT-PCR方法驗證ER陽性乳癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)

為驗證基因芯片結(jié)果的可靠性，在收集的40對ER陽性乳癌癌組織和癌旁正常組織（包括進(jìn)行芯片檢測的4對組織），選擇芯片結(jié)果中表達(dá)差異倍數(shù)最大的7個lncRNA應(yīng)用qRT-PCR方法進(jìn)行驗證。通過Trizol法提取組織的總RNA，按照說明書方法使用HiScriptⅢ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒將從組織中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，內(nèi)參照基因為U6。反應(yīng)完成后，應(yīng)用溶解曲線確定引物特異性，使用2-ΔΔCt法計算lncRNA的相對表達(dá)量。其中PCR引物由Thermo Fisher公司合成，其序列見表1。

1.7 qRT-PCR驗證ER陽性乳癌細(xì)胞株MCF-7中l(wèi)ncRNA的表達(dá)

乳癌細(xì)胞株MCF-7（由青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院中心實驗室饋贈）培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司）培養(yǎng)在專用完全培養(yǎng)基中，并分別加入10 g/L青鏈霉素雙抗。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中。應(yīng)用TRIZOL法提取MCF-7及MCF-10A的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用qRT-PCR方法檢測LINC01614、AC044784.1、CTD-2510F5.4等lncRNA在細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.8 lncRNA表達(dá)與乳癌疾病預(yù)后關(guān)系分析

通過TCGA在GDC數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選出ER陽性的乳癌病人共791例，根據(jù)病人的lncRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分組，以平均值為界分為高表達(dá)組和低表達(dá)組;通過R語言編輯器進(jìn)行轉(zhuǎn)換包“survival”;對所選擇的lncRNA行Kaplan-Meier曲線分析，與疾病預(yù)后的關(guān)系使用long-rank檢驗進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果以±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 ER陽性乳癌組織中mRNA以及l(fā)ncRNA的表達(dá)

通過基因芯片技術(shù)在4對ER陽性乳癌組織及癌旁正常組織中共篩選出3 949個具有差異表達(dá)的mRNA，其中，在癌組織中差異表達(dá)上調(diào)的mRNA有2 448個，差異表達(dá)下調(diào)的有1 501個，上調(diào)最明顯及下調(diào)最明顯的mRNA為CST2和CSF3，F(xiàn)C值分別為70.3和-14.4。用同樣的方法在癌組織中共篩選出4 050個具有差異表達(dá)的lncRNA，其中有1 589個lncRNA差異性高表達(dá)，而顯著性低表達(dá)lncRNA有2 461個。將差異表達(dá)的mRNA以及l(fā)ncRNA標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分別制作成聚類圖（圖1）。按差異倍數(shù)排序，選取前7位差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行驗證。見表2。

2.2 mRNA的功能分析

通過GO、KEGG及疾病富集通路分析，選取排名前30個最明顯富集的通路來進(jìn)一步預(yù)測具有差異表達(dá)的mRNA的功能。GO細(xì)胞學(xué)組件分析顯示，具有差異表達(dá)的mRNA多分布在核小體、DNA包裝復(fù)合體、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外膜、細(xì)胞質(zhì)膜等（圖2A）;GO生物學(xué)功能分析表明，差異表達(dá)mRNA生物學(xué)過程主要在細(xì)胞黏附、生物黏附、核小體裝配、單細(xì)胞黏附、DNA包裝、染色體聚集等富集明顯（圖2B）;GO分子功能分析顯示，具有差異表達(dá)的mRNA可能涉及的致病機(jī)制及通路極其豐富，如蛋白質(zhì)異二聚體活性、糖胺聚糖結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚體活性、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、MHC Ⅱ類受體活性等（圖2C）。KEGG富集通路分析顯示，mRNA主要通過T細(xì)胞激活、整合素信號通路、血液凝固、纖溶酶原級聯(lián)激活、FAS信號通路、半胱氨酸的生物學(xué)合成等在乳癌疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用（圖3A）;疾病富集通路分析顯示，在ER陽性乳癌中具有差異表達(dá)的mRNA主要在免疫系統(tǒng)疾病、過敏及自身免疫疾病、埃-當(dāng)二氏綜合征、骨骼肌疾病、成骨不全病、原發(fā)性免疫缺陷病中明顯富集（圖3B）。

2.3 差異表達(dá)的lncRNA與mRNA的相關(guān)性

通過對差異表達(dá)的lncRNA及mRNA進(jìn)行共表達(dá)分析，共篩選出關(guān)聯(lián)度最大的前1 000個關(guān)系對，用Cytoscape軟件繪制其網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3C。對網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示，WDR55、CEP85、OR5L2、GRIK2等mRNA和眾多具有差異表達(dá)的lncRNA存在顯著相關(guān)性。

2.4 qRT-PCR驗證

基于基因芯片篩選具有差異表達(dá)的lncRNA，選擇了差異表達(dá)最大的前7個，應(yīng)用qRT-PCR方法對40例ER陽性乳癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示LINC01614（t=10.380，P<0.01）、AC044784.1（t=3.490，P<0.01）、CTD-2510F5.4（t=3.235，P<0.01）共3個lncRNA在癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織上調(diào)，與本研究芯片結(jié)果一致;CTD-2116N17.1、KIAA0101、linc-BCL2A1-3、AL365436.2 lncRNA雖然在乳癌組織中表達(dá)上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。將上述具有差異性高表達(dá)的3個基因在ER陽性乳癌細(xì)胞株MCF-7及正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中驗證，結(jié)果顯示LINC01614（t=3.714，P<0.05）、AC044784.1（t=5.827，P<0.01）、CTD-2510F5.4（t=4.415，P<0.05）在乳癌細(xì)胞株MCF-7中同樣具有顯著性高表達(dá)。見表4。

2.5 lncRNA與ER陽性乳癌預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線法，在納入791例ER陽性乳癌病人中，將LINC01614、AC044784.1、CTD-2510F5.4在ER陽性乳癌病人的表達(dá)水平與疾病的總存活率進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果顯示，LINC01614表達(dá)水平的高低與疾病的預(yù)后生存顯著相關(guān)（χ2=7.50，P<0.01），LINC01614表達(dá)水平低的病人較LINC01614表達(dá)水平高者具有更長的無病生存期（圖4）。

3 討? 論

本文研究通過基因芯片技術(shù)，選取4例較Luminal A型乳癌預(yù)后更差、惡性程度更高的Luminal B型乳癌組織及其癌旁正常組織，篩選ER陽性乳癌具有差異表達(dá)的mRNA及l(fā)ncRNA，結(jié)果顯示，上調(diào)及下調(diào)最明顯的mRNA為CST2和CSF3。已有研究通過對6對乳癌的癌組織及癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的高通量測序，證實CST2基因在乳癌組織中高表達(dá)，并推測可能與ECM-受體相互作用信號相關(guān)[9-10]，但其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究證實。CHEN等[11]對MCF-7乳癌細(xì)胞株進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)基（OCM）及未分化成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基對照培養(yǎng)，然后用細(xì)胞因子抗體陣列進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示OCM處理的MCF-7細(xì)胞株中CSF3表達(dá)顯著性上調(diào)，且OCM和乳癌細(xì)胞的遷移相關(guān)，推測CSF3可能與乳癌的遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移有關(guān)。

對于本文組織驗證所選取的7個lncRNA，后續(xù)通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中乳癌數(shù)據(jù)分析顯示，它們均在乳癌組織中具有差異性高表達(dá)，與本文芯片結(jié)果相吻合。有研究者通過TCGA數(shù)據(jù)庫對837個浸潤性乳癌組織及105個正常組織的lncRNA基因譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LINC01614在PR陽性、ER陽性和HER2陽性乳癌高表達(dá)，而在三陰性乳癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，即在Luminal B/HER2陽性亞型乳癌中具有高表達(dá);并通過生物信息學(xué)和通路分析發(fā)現(xiàn)，LINC01614可能通過TGFβ和FAK信號的調(diào)控在乳癌疾病中發(fā)揮作用[12]。本研究基因芯片檢測結(jié)果同樣提示，LINC01614在ER陽性乳癌組織中具有差異性高表達(dá)，并且后續(xù)在ER陽性乳癌組織及細(xì)胞株中得到驗證;LINC01614可能成為預(yù)測ER陽性乳癌病人整體生存期的預(yù)后標(biāo)志物，并在臨床中對判斷預(yù)后和預(yù)測乳癌的治療效果可能存在價值。另外有研究指出，KIAA0101在乳癌中起著中心體數(shù)目調(diào)節(jié)劑的作用，敲低該基因可通過促進(jìn)乳癌中p53/Sp1復(fù)合物的形成來抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)程[13]，并推測該基因可能與雌激素的表達(dá)相關(guān)[14-17]。本文基因芯片技術(shù)檢測的研究結(jié)果也證實，KIAA0101在ER陽性乳癌中同樣具有高表達(dá);后續(xù)組織驗證結(jié)果提示該lncRNA在癌組織中雖有高表達(dá)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。究其原因，可能為組織標(biāo)本個體差異性大，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。

綜上所述，本文證實LINC01614、AC044784.1、CTD-2510F5.4在ER陽性乳癌組織及細(xì)胞中具有顯著性高表達(dá)。而LINC01614在ER陽性乳癌組織中的高表達(dá)可能與預(yù)后不良有關(guān)，其具體的細(xì)胞功能及作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。這些在ER陽性乳癌組織中差異表達(dá)的lncRNA可能作為新型的生物標(biāo)記物，為疾病的診斷及治療提供新的方向。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）