劉大偉

（白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林白城 137000）

多糖類物質(zhì)指10個(gè)分子以上的單糖經(jīng)糖苷鍵連接而成的高分子碳水化合物，廣泛存在于植物、菌類等有機(jī)體中，其不僅可作為細(xì)胞的結(jié)構(gòu)材料，同時(shí)也參與各項(xiàng)生命活動(dòng)，如：通過調(diào)節(jié)下游抗氧化酶基因的表達(dá)，減少體內(nèi)自由基和活性氧的生成，致使疾病的發(fā)生概率下降[1]；抑制外源性有害菌的生長(zhǎng)，改善體內(nèi)菌群環(huán)境，提高機(jī)體免疫能力[2]。

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，被國(guó)家衛(wèi)生部門認(rèn)定為藥食兩用植物，常作為保健食品的主要成分[3?4]，其富含黃酮類、皂苷類、多糖類及萜類等活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等活性[5?6]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃芩多糖的研究主要集中于對(duì)其提取及體內(nèi)、外抗氧化活性和對(duì)免疫因子的影響等方面[7?9]，而對(duì)其純化與抑菌活性的研究暫未有報(bào)道。由于黃芩多糖的提取產(chǎn)物仍含有較多雜質(zhì)，可能影響其功效的發(fā)揮，因此本研究以黃芩為原料，采用超聲法提取粗多糖后，利用大孔樹脂分離純化，探討不同條件對(duì)其純化效果的影響，同時(shí)通過濾紙片法研究該產(chǎn)物對(duì)不同有害菌的抑菌活性和最低抑菌濃度，從而為黃芩多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芩 購(gòu)于白城市吉林大藥房，經(jīng)白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校牛鶴麗老師鑒定為唇形科植物黃芩的干燥根；D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：110833-201908） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；無(wú)水乙醇、氯化鈉、苯酚、硫酸 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水 為純化水；大腸桿菌（CMCC（B）44102）、枯草桿菌（CMCC（B）63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003） 吉林北方微生物研究所；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；滅菌注射用水 華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司；牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 自制；青霉素鈉 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

LYSF-500-Y型粉碎機(jī) 長(zhǎng)沙卓成醫(yī)療器械有限公司；752N型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；JMB1001型電子天平 紹興景邁儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；H1650型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司；SHA-C型恒溫振蕩器 國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；AB-8、D101型大孔樹脂天津波鴻樹脂科技有限公司；H 103、DM130型大孔樹脂 西安藍(lán)曉科技有限公司；DM 301、HPD 600、HPD 400型大孔樹脂 北京索萊寶科技有限公司；JC-150B型恒溫恒濕箱 青島瑞明儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖粗提物制備 按照文獻(xiàn)方法[10]，制備黃芩多糖粗提物具體如下：黃芩根干燥至恒重后，粉碎完全，過60目篩，準(zhǔn)確稱取5.00 g，加入150 mL水后，于750 W、60 ℃條件下，超聲提取30 min減壓過濾，濃縮至30 mL，加入90%乙醇70 mL，沉淀過濾后，凍干即得。

1.2.2 多糖含量測(cè)定 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，加水溶解配制成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分別稀釋至0.02～0.1 mg/mL，隨后加入5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，水浴加熱15 min（溫度：100 ℃），冷卻至室溫后于490 nm測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度[11]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5.212x+0.021（r=0.9995），另于相同波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品的多糖含量。

1.2.3 不同樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫性能比較 不同類型的樹脂經(jīng)預(yù)處理后[12]，準(zhǔn)確稱取5.0 g置于3 mg/mL多糖提取液60 mL中，于室溫下振蕩吸附至飽和，測(cè)定飽和吸附后提取液中多糖濃度，過濾，樹脂置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇100 mL[13?14]，于室溫振蕩解吸至平衡，測(cè)得不同類型樹脂的飽和吸附量、吸附率、洗脫率和多糖回收率。

式中：c0為提取液中多糖濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后濾液中多糖濃度，mg/mL；m為樹脂干重，g；cd為洗脫液中多糖濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；?e為飽和吸附量，mg/g；Qe為飽和吸附率，%；Dd為洗脫率，%；R為回收率，%。

1.2.4 等溫吸附曲線 配制1、2、3、4、5 mg/mL多糖提取液60 mL分別置于裝有5 g AB-8型樹脂的錐形瓶?jī)?nèi)，于不同溫度下（25、35、45 ℃）振蕩吸附至飽和，測(cè)得樹脂的飽和吸附量，繪制等溫吸附曲線，同時(shí)分別采用Langmuir和Freundlich吸附模型對(duì)其線性擬合，描述其吸附過程[15?16]。

1.2.5 樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化

1.2.5.1 樹脂吸附條件考察 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以吸附率為考察指標(biāo)，在內(nèi)徑為30 mm，高度為36 cm的樹脂柱內(nèi)，分別研究不同的上樣液濃度、上樣液pH與上樣流速對(duì)AB-8型大孔樹脂吸附黃芩多糖的影響，具體如下：（a）當(dāng)上樣液pH為5、體積為60 mL，上樣流速為2 mL/min時(shí)，上樣濃度分別為：1、2、3、4、5 mg/mL；（b）當(dāng)上樣濃度為3 mg/mL，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為60 mL時(shí)，上樣液pH分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；（c）當(dāng)上樣濃度為3 mg/mL，上樣液pH為5.0時(shí)，繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)泄漏曲線。

1.2.5.2 樹脂解吸條件考察 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以洗脫率為考察指標(biāo)，分別研究洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)和流速對(duì)樹脂的解吸效果影響，具體如下：（a）當(dāng)洗脫流速為1 mL/min，洗脫液體積為180 mL時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為：55%、65%、75%、85%、95%；（b）當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)洗脫曲線。

1.2.6 抑菌活性分析

1.2.6.1 菌種活化與樣品配制 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種（接種量5%）后，于37 ℃培養(yǎng)24 h，制備105cfu/mL菌懸液，吸取2 mL涂布于平板中，制成含菌平板[17]。將黃芩多糖純化產(chǎn)物用無(wú)菌水溶解后，配制成10.0 mg/mL多糖溶液，依次稀釋成不同濃度（5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL），以確定最小抑菌濃度；另配制10.0 mg/mL青霉素鈉溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以無(wú)菌水為陰性對(duì)照[18]。

1.2.6.2 抑菌活性測(cè)定 采用濾紙片法考察黃芩多糖的抑菌活性，具體如下：直徑6 mm的滅菌圓紙片分別浸泡于相同濃度（10.0 mg/mL）的黃芩多糖溶液和青霉素鈉溶液及無(wú)菌水中2 h后，貼于布滿菌液的培養(yǎng)基平板中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，檢測(cè)抑菌圈直徑[19]，每個(gè)供試菌平行測(cè)定三次。

1.2.6.3 最小抑菌濃度測(cè)定 吸取1 mL不同濃度的黃芩多糖溶液置于19 mL液體培養(yǎng)基中，混勻后涂布于平板上，制成抑菌平板后，分別吸取0.1 mL三種菌液，接種于該平板上，另制備不加黃芩多糖的培養(yǎng)基平板作空白對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，通過肉眼觀察平板中有無(wú)菌落生長(zhǎng)，以確定黃芩多糖的最小抑菌濃度[20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組試驗(yàn)平行三次，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂類型選擇

不同類型樹脂的孔徑、比表面積與極性差別較大，因此對(duì)多糖化合物的吸附效果不一，為此分別考察七種樹脂對(duì)黃芩多糖的靜態(tài)吸附與解吸效果。從表1可見，不同樹脂型號(hào)對(duì)黃芩多糖的吸附具有一定的選擇性，H103樹脂對(duì)目標(biāo)化合物的吸附率最高，達(dá)到88.4%，這歸因于該樹脂的比表面積（≥ 900 m2/g）與平均孔徑（85～95 nm）較大，因此與多糖化合物相互作用較好，但較難解吸，而AB-8型樹脂的比表面積適中，且為弱極性，相對(duì)于極性與非極性樹脂更有利于多糖化合物的吸附與解吸，且其對(duì)黃芩多糖的回收率最高，達(dá)到76.5%，這與陳艷采用AB-8樹脂吸附松茸多糖研究結(jié)果較為相近[21]，因此確定以AB-8型樹脂純化黃芩多糖提取物。

表1 不同類型樹脂的靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果Table 1 Static adsorption and desorption performance of macroporous resins of different types

2.2 等溫吸附線

AB-8樹脂對(duì)黃芩多糖的等溫吸附線，見圖1所示。相同溫度下，隨著上樣液中黃芩多糖濃度的增大，飽和吸附量逐漸升高，但隨著溫度升高，飽和吸附量卻不斷下降，表明該吸附作用為放熱過程。Langmuir與Freundlich模型對(duì)不同等溫吸附線的擬合方程，見表2所示，其中Langmuir模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.98，表明該吸附過程更趨近于Langmuir吸附模型特征。

圖1 等溫吸附線Fig.1 Adsorption isotherms in different temperatures

表2 Langmuir與Freundlich模型擬合方程Table 2 Fitting equationsof Langmuir and Freundlich model

2.3 動(dòng)態(tài)吸附條件考察

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)AB-8型樹脂吸附黃芩多糖的影響，見圖2所示。隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附率先上升后下降，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1～3 mg/mL時(shí)，吸附率無(wú)顯著性變化（P＞0.05），而質(zhì)量濃度超過3 mg/mL時(shí)開始下降。這可能歸因于上樣液質(zhì)量濃度的增大，容易造成樹脂內(nèi)雜質(zhì)的增多，競(jìng)爭(zhēng)樹脂的吸附位點(diǎn)，致使吸附率下降[22]，因此確定最佳上樣液質(zhì)量濃度為3 mg/mL。

圖2 上樣液質(zhì)量濃度的選擇Fig.2 Selection of mass concentration of sample solution

2.3.2 上樣液pH對(duì)吸附率的影響 上樣液pH影響黃芩多糖的離子化程度，進(jìn)而影響樹脂對(duì)其的吸附作用，因此考察不同上樣液pH對(duì)AB-8型樹脂吸附黃芩多糖的影響，見圖3所示。樹脂對(duì)黃芩多糖的吸附率，隨pH的升高，先增大后減小，這歸因于溶液pH對(duì)多糖化合物的溶解度與化學(xué)性質(zhì)影響較大，在弱酸性條件下更容易以分子態(tài)被樹脂吸附[23]，因此確定最佳上樣液pH為5.0。

圖3 上樣液pH的選擇Fig.3 Selection of pH value of sample solution

2.3.3 樹脂泄漏曲線 隨著上樣液體積的增多，樹脂的吸附位點(diǎn)逐漸飽和，吸附能力開始下降。當(dāng)泄漏液中多糖濃度約為10%上樣液質(zhì)量濃度時(shí)，則出現(xiàn)泄漏點(diǎn)[24]，因此繪制不同上樣流速的樹脂泄漏曲線，見圖4所示。當(dāng)上樣流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)，泄漏點(diǎn)對(duì)應(yīng)的上樣液體積逐漸減小，這源于大孔樹脂對(duì)化學(xué)物質(zhì)的吸附，本質(zhì)為膜擴(kuò)散與粒擴(kuò)散，流速過快，其與樹脂的接觸時(shí)間愈短，擴(kuò)散效果越差[25]，綜合考慮后續(xù)實(shí)際應(yīng)用效率，確定最佳上樣流速為2.0 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖4 樹脂泄漏曲線Fig.4 Leakage curve of resin in different flow rate

2.4 動(dòng)態(tài)解吸條件考察

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率影響 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)樹脂內(nèi)黃芩多糖的解吸效果，如圖5所示。當(dāng)乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)增大至75%后，洗脫率開始下降，這歸因于黃芩多糖的極性較弱，因此易被一定極性的乙醇溶液洗脫，但乙醇的體積分?jǐn)?shù)過大，使得與多糖化合物的極性相差較大，因此確定乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為75%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇Fig.5 Selection of volume fraction of ethyl alcohol

2.4.2 樹脂洗脫曲線 不同洗脫流速下樹脂的洗脫曲線，如圖6所示，從圖6可知，隨著洗脫流速加快，曲線的峰形逐漸變寬，并有明顯拖尾，同時(shí)乙醇消耗量增大，而采用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脫時(shí)，洗脫曲線對(duì)稱，拖尾不明顯，同時(shí)對(duì)多糖化合物的洗脫集中，因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液體積為160 mL。

圖6 不同流速的洗脫曲線Fig.6 Elution curve in different elution velocity

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定AB-8型大孔樹脂純化黃芩粗多糖的最佳工藝條件為：3 mg/mL黃芩多糖提取物溶液（pH5.0）60 mL，以2.0 mL/min流速上樣至AB-8型樹脂飽和吸附后，采用75%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫，產(chǎn)物的多糖含量由26.25%±1.82%提高至77.12%±1.51%，約為純化前2.7倍，陳艷等[21]采用AB-8型大孔樹脂純化松茸多糖，產(chǎn)物純度約為純化前2.5倍，宮江寧等[26]采用FL-3型大孔樹脂純化龍膽草多糖，產(chǎn)物純度約為純化前2.8倍，表明該工藝分離純化效果較高，適于黃芩多糖提取物的純化。

2.6 黃芩多糖的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 黃芩多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌效果 黃芩多糖對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果，如表3所示。黃芩多糖對(duì)三種細(xì)菌均有一定的抑制作用，其中抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到（13.07±1.62）mm，而對(duì)枯草桿菌的抑制效果一般。陽(yáng)性對(duì)照采用的青霉素鈉則對(duì)三種細(xì)菌的抑菌作用均較強(qiáng)，特別是對(duì)枯草桿菌，抑菌圈直徑達(dá)到（15.38±1.24）mm。兩種物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑制無(wú)顯著差異（P＞0.05），但對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著性差異（P＜0.05），而對(duì)枯草桿菌的差異則有極顯著性（P＜0.01）。這與路俊仙等[27]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的黃芩均對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌和綠膿桿菌均有明顯抑制作用相似。

表3 不同樣品的抑菌圈直徑（n = 3）Table 3 Inhibitionzone diameter of different materials（n = 3）

2.6.2 最小抑菌濃度 不同濃度的黃芩多糖對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度，見表4所示。從表4可知，黃芩多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草桿菌的最小抑菌濃度分別為0.625、0.625、1.25 mg/mL，表明低濃度的黃芩多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性較強(qiáng)。

表4 黃芩多糖的最小抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration of polysaccharides of Scutellaria baicalensis Georgi

3 結(jié)論

探討了大孔樹脂純化黃芩多糖的最佳工藝條件并分析其抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 mg/mL黃芩多糖提取物溶液（pH 5.0）60 mL，以2.0 mL/min流速上樣至AB-8型樹脂飽和吸附后，采用75%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫時(shí)，產(chǎn)物的多糖含量由26.25%±1.82%提高至77.12%±1.51%，約為純化前2.7倍。通過體外抑菌活性試驗(yàn)顯示，純化后的黃芩多糖對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草桿菌的最小抑菌濃度分別為0.625、0.625、1.25 mg/mL可為黃芩多糖的深入開發(fā)與利用提供參考。