楊子帆，張 科，劉 瑩，王 益，黃 文

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的結(jié)構(gòu)蛋白，也是細胞外基質(zhì)中主要組成成分之一。膠原蛋白廣泛存在于哺乳和水產(chǎn)動物的皮、骨等器官組織，由于膠原蛋白具有低免疫原性且生物相容性良好，被廣泛用于化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。目前膠原蛋白主要來源于哺乳動物的皮和跟腱組織，受人畜共患病以及宗教問題的影響，人們開始從魚類中提取膠原蛋白進行研究。近年來，魚類膠原蛋白理化性質(zhì)和生物活性的相關(guān)研究日益增加，為魚類膠原蛋白的發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)[2]。

鱘魚是世界現(xiàn)有淡水魚中體型較大，壽命較長的魚類，隨著我國鱘魚養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，鱘魚養(yǎng)殖的總量每年呈增長趨勢[3]。鱘魚加工過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物魚鰾，其膠原蛋白含量豐富，可以作為魚類膠原蛋白的來源。目前對鱘魚魚鰾膠原蛋白的研究中：蔣玉[4]從鱘魚魚鰾中提取膠原蛋白，通過大鼠飼喂實驗發(fā)現(xiàn)可以延緩大鼠皮膚自然衰老，具有良好的生物安全性；張曦[5]從鱘魚軟骨、皮、和魚鰾中得到膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)魚鰾膠原蛋白有更好的原纖維形成能力。草魚魚鰾膠原蛋白是淡水魚鰾中研究較多且來源廣的蛋白[6?7]，而鱘魚魚鰾與常見淡水魚的魚鰾不同，為了探究鱘魚魚鰾膠原蛋白與常見淡水魚魚鰾膠原蛋白理化性質(zhì)的差異，選取草魚魚鰾作為對比進行研究。膠原蛋白提取的方法有鹽法、酸法、酶法和熱水法，其中酶法提取膠原蛋白對膠原蛋白天然三螺旋結(jié)構(gòu)影響最小且生物安全性高[8]。

故本研究以人工養(yǎng)殖的鱘魚魚鰾和草魚魚鰾為原料，測定兩種魚鰾的基本營養(yǎng)成分，通過酶法制備兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白（PSC），對兩種魚鰾PSC理化性質(zhì)比較分析，探究鱘魚魚鰾PSC與普通淡水魚草魚魚鰾PSC的差異性，為鱘魚魚鰾在食品和生物材料領(lǐng)域發(fā)展應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱘魚魚鰾 嫦娥創(chuàng)新（武漢）生物科技有限公司；草魚魚鰾 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)中百超市；異丙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、冰乙酸、鹽酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司（分析純）；胃蛋白酶（1:3000）、L-羥脯氨酸 索萊寶科技有限公司。

LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；MicroDSCIII微量熱儀 法國SETARAM公司；UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津公司；NEXUS-470傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；J-1500圓二色譜儀、L-8900氨基酸自動分析儀日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩種魚鰾基本營養(yǎng)成分的測定 水分含量根據(jù)GB 5009.3-2016中的直接干燥法測定；灰分根據(jù)GB 5009.4-2016測定；蛋白質(zhì)含量的測定根據(jù)GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定；脂肪含量的測定根據(jù)GB 5009.6-2016中的索氏抽提法測定；總糖含量根據(jù)GB/T 9695.31-2008中的分光光度法測定；羥脯氨酸（Hyp）含量根據(jù)氯胺T比色法測定[9]。

1.2.2 兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白的制備 以下操作均在4 ℃下進行，因為原材料差異，采用不同的方法對兩種魚鰾進行膠原蛋白提取前的預(yù)處理。

1.2.2.1 鱘魚魚鰾的預(yù)處理 將從鱘魚魚鰾內(nèi)膜剝下來的內(nèi)層浸泡于4 mol/L的NaCl溶液中24 h（料液比為1:20）[4]。用勻漿機以5000 r/min勻漿5 min。將其置于磁力攪拌器上輕微攪拌24 h，以脫除雜蛋白，每8 h換一次液。然后用蒸餾水漂洗3次，將其浸泡于10%的異丙醇中脫脂24 h（料液比為1:20），用蒸餾水漂洗3次。下一步進行酶溶性膠原蛋白提取。

1.2.2.2 草魚魚鰾的預(yù)處理 先將草魚魚鰾剪成大小為0.5 cm×0.5 cm的片段，將剪好的草魚魚鰾在0.1 mol/L 的NaOH中輕微攪拌24 h（料液比為1:20），以脫除雜蛋白[5?6]。然后用蒸餾水將魚鰾漂洗至中性，將其浸泡于10%的異丙醇中脫脂24 h（料液比為1:20），用蒸餾水漂洗3次。下一步進行酶溶性膠原蛋白的提取。

1.2.2.3 兩種魚鰾酶溶性膠原蛋白（PSC）的提取、純化及膠原蛋白得率計算 將預(yù)處理好的鱘魚魚鰾和草魚魚鰾用含有胃蛋白酶（1:3000）的乙酸溶液（0.5 mol/L）緩慢攪拌48 h，胃蛋白酶的添加量為各魚鰾干重的2%，料液比為1:100，于10000 r/min離心10 min后收集上清液，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH至7.5[4?7]。向上清液中多次緩慢攪拌加入提前碾磨好的NaCl粉末直至NaCl濃度達到2.5 mol/L為止，攪拌2 h，靜置12 h，于10000 r/min離心10 min后，收集沉淀，用0.5 mol/L乙酸（料液比1:30）緩慢攪拌至沉淀溶解。將其裝入截留分子量為14 kDa的透析袋中[10]（盡量避免帶入氣泡），分別用0.1 mol/L乙酸、0.05 mol/L乙酸與蒸餾水各透析2天，最后用真空冷凍干燥機干燥得到兩種魚鰾PSC，按照下式計算膠原蛋白得率。

1.2.3 SDS-PAGE分析 參考LaemmLi[11]對兩種魚鰾PSC進行電泳分析。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%。用預(yù)冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使其濃度達到2.5 mg/mL，與上樣緩沖液混合（膠原蛋白溶液:上樣緩沖液=4:1），煮沸3 min，10000 r/min離心5 min，取10 μL上清液上樣，Marker上樣量為5 μL。跑濃縮膠電壓為80 V，時間約為0.5 h。待條帶進入分離膠后，電壓調(diào)至120 V，時間約為1.5 h。采用考馬斯亮藍R250溶液進行染色，用50%甲醇與6.8%醋酸溶解R250，振蕩染色4 h。用5%甲醇與7.5%醋酸脫色至無背景色，然后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并分析各條帶的分子質(zhì)量，商業(yè)明膠作為對照組。

1.2.4 氨基酸組成分析 取凍干后的兩種魚鰾PSC各100 mg，取5 mL的6 mol/L HCl，110 ℃下水解24 h[10]。將溶液注入氨基酸自動分析儀，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對比，氨基酸含量記為每1000個殘基對應(yīng)的氨基酸殘基個數(shù)。

1.2.5 紫外光譜分析 稱取適量的兩種魚鰾PSC，用預(yù)冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使膠原蛋白濃度達到1 mg/mL。用紫外分光光度計對膠原蛋白溶液進行190～400 nm波長掃描[12]。

1.2.6 紅外光譜分析 參考Pal等[13]方法，稱取1～2 mg的兩種魚鰾PSC樣品加入200 mg左右干燥后的KBr中，在瑪瑙研缽中按一個方向碾細，取適量放入擦拭干凈的模具，置于真空壓片機中關(guān)閉放氣閥并加壓至20 MPa持續(xù)1～2 min，將制備好樣品的壓片放入樣品室中，用傅里葉紅外分析儀進行400～4000 cm?1掃描，并以單純的KBr壓片掃描作為背景。

1.2.7 圓二光譜分析 稱取適量的兩種魚鰾PSC樣品，用預(yù)冷的蒸餾水在4 ℃下攪拌溶解，使膠原蛋白濃度達到0.5 mg/mL。常溫下在190～260 nm波長范圍內(nèi)掃描，掃描速率為20 nm/min，間隔0.1 nm[14]。

1.2.8 熱變性溫度測定 將兩種魚鰾PSC與蒸餾水按1:40混合，充分溶脹24 h（4 ℃）。于8000 r/min離心3 min以脫除氣泡，取適量膠原蛋白溶液加入微量熱儀測定其熱變性溫度（Td）[15]。升溫速率為0.5 ℃/min，溫度范圍在10～60 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，每個指標(biāo)測三次平行，統(tǒng)計結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種魚鰾基本營養(yǎng)成分比較和膠原蛋白得率分析

表1 為兩種魚鰾的基本營養(yǎng)成分和膠原蛋白得率的結(jié)果。從表1可見鱘魚魚鰾的水分含量顯著低于草魚魚鰾（P＜0.05）；為了減少誤差，除了水分，其它成分以干基計，兩種魚鰾蛋白質(zhì)含量都較高；鱘魚魚鰾粗脂肪的含量為5.31%，顯著高于草魚魚鰾3.51%（P＜0.05）；兩種魚鰾灰分、總糖的含量差異不顯著（P＞0.05）。兩種魚鰾在干基下蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異（P＞0.05），但是鱘魚魚鰾中羥脯氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾（P＜0.05）；同時鱘魚魚鰾PSC得率80.63%顯著高于草魚魚鰾PSC得率49.85%（P＜0.05）。在動物體內(nèi)羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，可以測定羥脯氨酸，乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)11.1來估算兩種魚鰾膠原蛋白的含量[16]。汪安利等[17]研究發(fā)現(xiàn)魚鰾的基本營養(yǎng)成分因種屬的不同而有所差異，不同種屬的干魚鰾營養(yǎng)成分中蛋白質(zhì)含量最高，脂肪含量偏低。這兩種魚鰾的營養(yǎng)成分組成符合這一結(jié)論。

表1 鱘魚、草魚魚鰾基本營養(yǎng)成分及膠原蛋白得率（除水分均以干基計）Table 1 The basic nutrients of sturgeon and grass carp swim bladder and the yield of collagen (except for water, all on dry basis)

2.2 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖1 為兩種魚鰾PSC和明膠的電泳條帶，可見兩種魚鰾PSC的電泳條帶與明膠的電泳條帶差別非常大，兩種魚鰾PSC都含有兩條遷移率不同的α鏈（α1和α2）及它們的二聚體β鏈和三聚體γ鏈，兩種魚鰾PSC的α1鏈含量均比α2含量高，且α鏈的相對分子質(zhì)量都在120～150 kDa之間，β鏈和γ鏈的相對分子質(zhì)量也在200 kDa以上。這些特征與報道的I型膠原蛋白電泳條帶一致[18]。從電泳圖中也可以看出兩種PSC的差異，草魚魚鰾PSC的α鏈的相對分子質(zhì)量要高于鱘魚魚鰾PSC，同時草魚魚鰾PSC的二聚體β鏈含量也比鱘魚魚鰾PSC的含量要高。

圖1 兩種魚鰾PSC和明膠的電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoretic patterns of two kinds of swim bladder PSC and gelatin

2.3 氨基酸組成分析結(jié)果

表2 為兩種魚鰾PSC氨基酸組成。從表2可見，兩種魚鰾PSC的氨基酸組成中的天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸含量沒有顯著性差異（P＞0.05），鱘魚魚鰾PSC中的絲氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾PSC（P＜0.05），草魚魚鰾PSC中的丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量顯著高于鱘魚魚鰾PSC（P＜0.05）。

表2 兩種魚鰾PSC的氨基酸組成（殘基個數(shù)/1000個殘基）Table 2 Amino acid composition of two kinds of swim bladder PSC（AA/1000 AA）

李國英等[19]報道I型膠原蛋白氨基酸組成特點：甘氨酸的含量占30%左右，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量占20%左右，哺乳動物膠原蛋白中亞PSC紫外最大吸收峰的位置不同，但都在230 nm附近，符合I型膠原蛋白紫外光譜特征。氨基酸含量較高，通常高于魚類膠原蛋白，豬皮和牛皮膠原蛋白中亞氨基酸含量分別是22%和21.5%。鱘魚和草魚魚鰾PSC的甘氨酸的含量分別是34.9%和35.3%，亞氨基酸的含量分別是17.9%和19.5%。豬皮和牛皮膠原蛋白中亞氨基酸含量都高于兩種魚鰾PSC，與報道相符?？赡苁且驗榉N屬和生長環(huán)境的差異導(dǎo)致兩種魚鰾中提取的PSC的氨基酸組成中大部分氨基酸含量存在明顯差異，但兩種魚鰾PSC的氨基酸組成都符合I型膠原蛋白的特征。

2.4 紫外光譜分析結(jié)果

圖2 為兩種魚鰾PSC紫外光譜。其中鱘魚魚鰾PSC最大吸收峰為227 nm，草魚魚鰾PSC最大吸收峰為228 nm。據(jù)報道[20]，大多數(shù)蛋白質(zhì)在波長280 nm附近有最大吸收峰，這主要是色氨酸殘基的吲哚環(huán)和酪氨酸殘基的酚基引起的，而I型膠原蛋白紫外最大吸收峰在230 nm左右。盡管兩種魚鰾

圖2 兩種魚鰾PSC的紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectra of two kinds of swim bladder PSC

2.5 紅外光譜分析結(jié)果

圖3 為兩種魚鰾PSC紅外光譜，可見兩種魚鰾PSC紅外光譜都具有I型膠原蛋白典型的五條紅外吸收酰胺帶，但每個酰胺帶的峰位不同。其中酰胺A帶歸屬于N-H伸縮振動，酰胺B歸屬于-CH2不對稱伸縮振動，酰胺I帶歸屬于C=O伸縮振動，酰胺II帶歸屬于N-H彎曲振動和C-N伸縮振動，酰胺III帶歸屬于N-H彎曲振動[21]。

圖3 兩種魚鰾PSC的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of two kinds of swim bladder PSC

根據(jù)Doyle理論[22]，酰胺A帶中當(dāng)N-H的氫鍵鍵合程度比較高時，吸收波數(shù)就會藍移，振動頻率就會降低。草魚魚鰾PSC的酰胺A帶位置的波數(shù)要比鱘魚魚鰾PSC大，表明鱘魚魚鰾PSC分子間可能形成較廣泛的氫鍵鍵合。

Payne等[23]報道酰胺I帶和酰胺II帶兩個峰的振動頻率與膠原蛋白分子的有序度和交聯(lián)度呈正相關(guān)。圖中草魚魚鰾PSC兩個酰胺帶峰的振動頻率都稍高于鱘魚魚鰾PSC，表明草魚魚鰾PSC具有比鱘魚魚鰾PSC較高的有序度和交聯(lián)度。

總的來講，從紅外光譜中可以看出兩種魚鰾膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)相似但也存在一定差異，草魚魚鰾PSC中有較高的分子有序度和分子間交聯(lián)度，而鱘魚魚鰾PSC中擁有較多的氫鍵。

2.6 圓二光譜分析結(jié)果

圖4 為兩種魚鰾PSC和明膠的圓二光譜，兩種魚鰾PSC圓二光譜中負峰的吸收波長為200 nm，正峰的吸收波長為220 nm，而明膠沒有正峰。Sreerama等[24]報道膠原蛋白溶液的圓二光譜特征：在200 nm左右存在一強負吸收峰，在220 nm左右存在一弱正吸收峰。Feng等[25]報道，若膠原蛋白的圓二光譜中的正負吸收峰的強度比值的絕對值Rpn值小于1，即可判斷其存在三螺旋結(jié)構(gòu)。兩種魚鰾PSC圓二光譜的正負吸收峰的位置與報道的膠原蛋白圓二光譜相符，其中鱘魚魚鰾PSC的Rpn=0.17，草魚魚鰾PSC的Rpn=0.16，兩者都小于1，圓二光譜特征說明這兩種不同來源的魚鰾PSC二級結(jié)構(gòu)相似且都保持了較為完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖4 兩種魚鰾PSC和明膠的圓二光譜Fig.4 Circular dichroic spectra of two kinds of swim bladder PSC and gelatin

2.7 熱變性溫度測定結(jié)果

圖5 是兩種魚鰾PSC的DSC結(jié)果，可見草魚魚鰾PSC的變性溫度為36.01 ℃，高于鱘魚魚鰾PSC的熱變性溫度為29.26 ℃（P＜0.05）。

圖5 兩種魚鰾PSC的DSC結(jié)果Fig.5 DSC results of two kinds of fish bladder PSC

膠原蛋白的熱穩(wěn)定性是重要的理化性質(zhì)指標(biāo)[26]。研究報道魚類膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與魚類的生活環(huán)境和溫度有關(guān)，通常冷水魚低于溫水魚[27?28]。Kimura等[29]研究阿拉斯加狹鱈魚魚鰾膠原蛋白的變性溫度為18.4 ℃，因為屬于冷水魚，所以它的熱穩(wěn)定性較差。其中鱘魚的生長適宜溫度在20～25 ℃，草魚的生長適宜溫度在27～32 ℃[30]，可判斷其熱穩(wěn)定性可能與其生存環(huán)境溫度相關(guān)。同時膠原蛋白的熱穩(wěn)定性和氨基酸組成有一定的聯(lián)系，但不同的學(xué)者有不同的結(jié)論。Ikoma等[31]研究表明亞氨基酸中存在著吡啶環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)對膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起重要作用，所以膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨基酸的含量存在正相關(guān)性。而Nagai等[32]研究表明羥脯氨酸中的羥基結(jié)構(gòu)有助于形成內(nèi)的氫鍵鍵合，可以提高三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，故脯氨酸的羥基化程度與膠原蛋白的熱變性溫度存在正相關(guān)性。氨基酸組成分析中鱘魚魚鰾PSC的亞氨基酸含量是17.9%，脯氨酸的羥基化程度是57.5%，草魚魚鰾PSC中亞氨基酸含量是19.5%，脯氨酸的羥基化程度是49.6%。造成鱘魚魚鰾PSC和草魚魚鰾PSC熱穩(wěn)定差異的原因更接近Ikoma的理論，即亞氨基酸的含量偏低導(dǎo)致鱘魚魚鰾PSC的變性溫度低于草魚魚鰾PSC的變性溫度。

綜合分析,兩種魚生長的環(huán)境溫度以及兩種魚鰾PSC中亞氨基酸含量可能是造成兩種魚鰾PSC熱穩(wěn)定性具有顯著性差異的原因。

3 結(jié)論

鱘魚魚鰾基本營養(yǎng)成分中的粗脂肪和羥脯氨酸含量均顯著高于草魚魚鰾（P＜0.05）；鱘魚魚鰾PSC得率80.63%顯著高于草魚魚鰾PSC得率49.85%（P＜0.05）；兩種魚鰾PSC都屬于I型膠原蛋白；兩種魚鰾PSC具有相似的二級結(jié)構(gòu)；鱘魚魚鰾PSC的α鏈相對分子質(zhì)量和二聚體β鏈的含量都低于草魚魚鰾PSC；氨基酸組成中鱘魚魚鰾PSC中的絲氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸和精氨酸的含量顯著高于草魚魚鰾PSC（P＜0.05），草魚魚鰾PSC中的丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量顯著高于鱘魚魚鰾PSC（P＜0.05）；鱘魚魚鰾PSC的變性溫度29.26 ℃顯著低于草魚魚鰾PSC變性溫度36.01 ℃（P＜0.05）。從鱘魚魚鰾和草魚魚鰾中所得到的PSC雖都屬于I型膠原蛋白，但草魚魚鰾PSC有更好的熱穩(wěn)定性，鱘魚魚鰾PSC有更高的得率。