胡嚴(yán)杰 龔世偉 任易

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作為常用的一線抗結(jié)核藥品[1-2]，能在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)，中性條件下以POA-的形式存在，一部分POA-通過外排作用轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，在酸性環(huán)境下，POA-被還原成不帶電荷的POA分子。由于POA的動態(tài)平衡，不帶電荷的分子再次被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，因為POA進(jìn)入細(xì)胞時帶一個質(zhì)子，經(jīng)過大量累積后使細(xì)胞質(zhì)酸化，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，從而發(fā)揮抗結(jié)核作用[3-5]。此外，PZA也可將治療周期從9～12個月縮短至6個月[6]。因此，成為結(jié)核病短程化療的基石。

PZase是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的pncA(561 bp)基因編碼的蛋白，PZase編碼基因及其啟動子序列的突變是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[7-8]，也是PZA耐藥的主要原因。PZase編碼基因及其啟動子序列的突變形式包括點突變、插入和缺失，可能發(fā)生突變的堿基幾乎覆蓋了整個基因，因此不便于應(yīng)用常用的基于探針雜交的分子檢測技術(shù)。Surveyor酶是植物中提取的核酸內(nèi)切酶，它可特異性切割DNA錯配部位，無特異酶切核苷酸序列，并已用于MTB乙胺丁醇耐藥基因突變的檢測[9]。本研究采用核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法測定MTB對PZA耐藥性，并與BACTEC MGIT 960法檢測結(jié)果和基因測序結(jié)果進(jìn)行對比，評估該方法的臨床應(yīng)用價值。

材料和方法

一、菌株來源

MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)、PZA耐藥的MTB標(biāo)準(zhǔn)株BCG(ATCC 34540)，以及91株(選取106株，最終復(fù)蘇成功91株)耐多藥MTB菌株均來自武漢市肺科醫(yī)院。

二、 PCR擴增

50 μl PCR擴增體系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板分別來自H37Rv、BCG或91株耐多藥MTB臨床分離株，其中H37Rv擴增時上游引物∶下游引物分別為1∶1、5∶4、5∶3、5∶2；臨床株擴增時上游引物∶下游引物分別為1∶1、4∶5、3∶5、2∶5，最后加dd H2O補足至50 μl。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、 DNA雜交

PCR結(jié)束后將標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的擴增產(chǎn)物和臨床分離株的擴增產(chǎn)物以1∶1的比例混合，95 ℃加熱10 min后，以2 ℃/s降溫至85 ℃，保持1 min。然后以0.3 ℃/s降溫至25 ℃。每隔10 ℃保持1 min。

四、 Survey酶酶切法

取20 μl雜交混合液，加入1 μl的Surveyor Enhaner S、1 μl的Surveyor Nuclease S和2 μl的0.15 mol/L的MgCl2?；靹蚝?2 ℃孵育1 h。取出后加入2.5 μl的終止液。

五、 BACTEC MGIT 960法檢測MTB對PZA耐藥性

使用BACTEC MGIT 960法檢測PZA的耐藥性，試劑由美國BD公司提供，并按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，其中接種0.5 ml菌懸液更改為0.25 ml，且PZA使用濃度為100 μg/ml。

六、 基因測序檢測MTB對PZA耐藥性

提取耐多藥MTB臨床分離菌株后進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)獲取H37Rv的pcnA基因序列，設(shè)計并合成引物。上游：5′-GTCATGGACCCTATATCTGTGGCTGCCGC-GTCG-3′；下游：5′-TCAGGAGCTGCAAACCAA-CTCGACGCTGG-3′。50 μl PCR擴增體系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板，2 μl上游引物，2 μl下游引物，16 μl dd H2O。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。? μl的擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增是否成功，擴增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化及測序。從NCBI獲取H37Rv的pncA基因的堿基序列，使用Clone Manager 8.0軟件將所有的基因測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)基因堿基序列進(jìn)行比對，找出突變位點及突變類型。

七、 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用百分比(%)表示?；驕y序結(jié)果采用Clone Manager 8.0軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測方法的建立

注 從左到右的加樣順序為：1～4孔為1∶1的H37Rv分別與2∶5、3∶5、4∶5、1∶1的BCG雜交后酶切，5～8孔為5∶4的H37Rv分別與BCG雜交后酶切，9～10、12～13孔為5∶3的H37Rv分別與BCG的雜交后酶切，14～17孔為5∶2的H37Rv分別與BCG的雜交后酶切，11孔為Marker，Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp圖1 核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測(引物配比摸索)電泳圖

圖1顯示，第13和14孔的產(chǎn)物條帶最亮，且區(qū)分度最高，其中第13孔是由5∶3(上游引物∶下游引物)H37Rv為模板的擴增產(chǎn)物與1∶1(上游引物∶下游引物)BCG臨床株為模板的擴增產(chǎn)物雜交后的酶切條帶，第14孔是由5∶2(上游引物∶下游引物)H37Rv為模板的產(chǎn)物與2∶5(上游引物∶下游引物)BCG為模板的產(chǎn)物雜交后的酶切條帶。兩者的雜交帶和酶切產(chǎn)物帶的亮度均較為接近，考慮到引物的使用，最終選擇上游引物∶下游引物為5∶2 擴增H37Rv，選擇上游引物∶下游引物為2∶5擴增臨床耐多藥MTB菌株來檢測臨床耐多藥MTB菌株的PZA耐藥性。

二、核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測MTB對PZA的耐藥性

當(dāng)電泳圖上的酶切孔只有1條電泳條帶時判定其為野生型，即為敏感株；當(dāng)電泳圖上的酶切孔有≥2條電泳條帶且與雜交孔條帶對比不一致時判定為突變株，即為耐藥株。如果電泳圖出現(xiàn)酶切孔有>2條電泳條帶且與雜交孔的條帶一致，則視為無效結(jié)果，需要重做。H37Rv電泳酶切孔只有1條電泳條帶，BCG雜交孔只有1條電泳條帶，酶切孔有3條電泳條帶，判定檢測結(jié)果有效(圖2，3)。

注 Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp(標(biāo)準(zhǔn)品為核酸內(nèi)切酶Surveyor酶廠家提供)圖2 MTB標(biāo)準(zhǔn)品雜交條帶及酶切條帶電泳圖

注 從左至右1、3、5、7、11、13、15、17孔為酶切條帶，2、4、6、8、12、14、16、18孔為相對應(yīng)的雜交條帶，9、19孔為Marker(10孔為無效孔，沒有點樣)，Marker條帶大小自下而上分別為100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp。其中5、6孔為BCG，突變位點為168 bp處，7、8孔為H37Rv，10號孔為無效孔，1～2和3～4孔為突變菌株孔，突變位點分別為36 bp與488 bp處，13、14孔為無效結(jié)果孔，其余為無突變菌株孔圖3 MTB臨床株雜交條帶及酶切條帶電泳圖

三、以BACTEC MGIT 960法為對照分析核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法的檢測效能

以BACTEC MGIT 960法為對照，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株對PZA耐藥性的敏感度為100.0%(29/29)，特異度為87.1%(54/62)，準(zhǔn)確度為91.2%(83/91)。

四、以基因測序結(jié)果為對照分析核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法的檢測效能

以基因測序結(jié)果為對照，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株pncA基因及其啟動子序列突變的敏感度為100.0%(37/37)，特異度為100.0%(54/54)，準(zhǔn)確度為100.0%(91/91)。37株MTB突變株中29株經(jīng)BACTEC MGIT 960法檢測為耐藥株，耐藥突變率為78.4%，54株野生株全部經(jīng)BACTEC MGIT 960檢測為敏感株。

討 論

核酸內(nèi)切酶Surveyor酶是一種特殊的核酸內(nèi)切酶，它沒有特異酶切位點，但它可特異性識別和切割DNA錯配部位，因此核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法不需要知道MTB的pncA及其啟動子區(qū)域的突變位置和類型，即可完成對其突變情況的檢測。而且該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于其他疾病的基因突變檢測中[10-11]，但在結(jié)核病檢測方面應(yīng)用較少。本研究以基因測序結(jié)果作為對照，共檢測了91株耐多藥MTB菌株的pncA基因及其啟動子序列的突變情況，與基因測序結(jié)果相比，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均為100.0%，且其酶切條帶大小與突變位置基本一致。張霞等[9]的研究顯示，使用核酸內(nèi)切酶Surveyor酶檢測線粒體基因相關(guān)突變時能檢測出使用基因測序檢測時檢測出的突變位點，還能檢測出未知的突變位點；同時Shi等[12]使用核酸內(nèi)切酶Surveyor酶法檢測MTB對乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因的突變，其與基因測序相比的一致率也高達(dá)100%，本研究的結(jié)果與張霞等[9]、Shi等[12]的結(jié)果一致；同時本研究的突變位點控制在可知的范圍內(nèi)，因此，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法能夠有效檢測出MTB的pncA基因突變情況。核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法與基因測序的一致率高達(dá)100%，可為MTB的pncA及其啟動子序列突變檢測提供新的思路。

此外，本研究以BACTEC MGIT 960法為對照，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測91株耐多藥MTB菌株P(guān)ZA耐藥性的敏感度為100.0%，特異度為87.1%，準(zhǔn)確度為91.2%。Shi等[12]使用核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切10株MTB臨床分離株的pncA基因，并與該菌株的PZase活性進(jìn)行比較，其敏感度、特異度及準(zhǔn)確度分別為100.0%、66.7%及88.9%。本研究與其相比特異度差異較大，可能是因為Shi等[12]選擇的菌株較少，且僅有2株敏感株。雖然本研究及Shi等的研究都獲得了100%的敏感度，但BACTEC MGIT 960法判定的PZA耐藥菌株中大約有90%左右的菌株發(fā)生了pncA及啟動子序列的基因突變[13-14]，因此，本研究獲得的100%敏感度與抽樣誤差有關(guān)。

本研究中37株MTB突變株檢測出29株耐藥株，耐藥突變率為78.4%，54株野生株全部為敏感株。與Ramirez-Busby和Valafar[8]的Meta分析結(jié)果稍有不一致，可能與本研究選擇的樣本量較少有關(guān)。而37株MTB突變株中有8株為BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法鑒定的敏感株，進(jìn)一步說明了MTB對PZA耐藥性與pncA基因的突變高度相關(guān)，同時還可能存在其他的MTB菌株對PZA耐藥的機制[15]。此外，MTB菌株發(fā)生突變但不耐藥的原因可能是因為pncA及其啟動子序列的突變只引起了很低的PZase活性的降低，導(dǎo)致很低程度的PZA耐藥。這種降低沒有達(dá)到表型藥物敏感性試驗可檢測出的程度，而且這種程度的耐藥可能不會引起臨床問題。

綜上，核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法檢測MTB的pncA基因及其啟動子序列突變的性能與基因測序高度一致。雖然核酸內(nèi)切酶Surveyor酶切法具有快速、操作簡便、價格低廉的特點，可以在沒有基因測序條件的地區(qū)作為MTB對PZA耐藥檢測的備選方案。但該方法不能夠判斷結(jié)果中的突變類型，不能有效區(qū)分同義突變和錯義突變，不能對該部分造成的假陽性結(jié)果進(jìn)行有效的區(qū)分；同時本研究的標(biāo)本量有限，結(jié)果還需要更多的標(biāo)本驗證。