王雪艷，肖明霞，王乙茹，柳成東，趙 平，王春羲，屈 娥*，程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；3.昆明三正生物科技（集團(tuán)）有限公司，昆明 650217）

自2020年7月1日我國(guó)飼料與養(yǎng)殖業(yè)全面禁止促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑的使用以來(lái)，飼用益生菌等功能性“替抗”飼料添加劑的評(píng)估與應(yīng)用技術(shù)受到行業(yè)高度關(guān)注[1-2]。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）兼具乳酸類益生菌的抑菌作用和芽孢桿菌屬益生菌的良好耐熱性，因此近年來(lái)成為行業(yè)替代飼用抗生素應(yīng)用與研究的焦點(diǎn)[3-5]。目前，大部分文獻(xiàn)表明凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著改善畜禽生長(zhǎng)性能[6-13]，但也有少數(shù)報(bào)道顯示飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽生長(zhǎng)性能沒有明顯的改善作用[14-18]。以上飼養(yǎng)試驗(yàn)報(bào)道的矛盾提示，評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的飼養(yǎng)試驗(yàn)易受試驗(yàn)動(dòng)物、養(yǎng)殖條件、試驗(yàn)設(shè)計(jì)等諸多因素的干擾[5,19]，且飼養(yǎng)試驗(yàn)周期長(zhǎng)、研究經(jīng)費(fèi)高。因此，建立體外科學(xué)、高效的實(shí)驗(yàn)室評(píng)估方法與技術(shù)有助于益生菌產(chǎn)品的初步篩選。

抑菌性能是飼用益生菌平衡畜禽腸道菌群、促進(jìn)生產(chǎn)性能的重要機(jī)制之一[3-5]。因此，針對(duì)畜禽腸道主要有害菌及有益菌，采用體外抑菌試驗(yàn)技術(shù)評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌性能，能夠驗(yàn)證飼用凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽體內(nèi)發(fā)揮平衡腸道菌群、促進(jìn)生長(zhǎng)的確切作用效果。常用的體外抑菌試驗(yàn)法包括：牛津杯法[20-21]、最小抑菌濃度法[22]、殺菌能力法[23]、平板劃線法[24]等。其中，牛津杯法常用于各類抗生素及益生菌的抑菌性能評(píng)估[20-21,25]。據(jù)此，本研究以廣譜飼用抗生素土霉素為參照，開展一株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌及有益菌的抑菌作用評(píng)估，以期驗(yàn)證以往飼用凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的作用效果。

1 材料

凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號(hào)為YNAU 5517），從云南省西雙版納州景洪市農(nóng)村散養(yǎng)茶花雞的腸道獲得[26]；土霉素，購(gòu)買于昆明三正生物科技（集團(tuán)）有限公司；抑菌試驗(yàn)的7個(gè)指示菌，包括大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringensCVCC2027）、羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525），購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究設(shè)計(jì)3個(gè)處理組，分別為陰性對(duì)照（無(wú)菌蒸餾水）組、陽(yáng)性對(duì)照組（土霉素）、凝結(jié)芽孢桿菌組。采用牛津杯法對(duì)比評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)以上2類（腸道有害菌、腸道有益菌）7個(gè)指示菌的抑制效果。土霉素的濃度依據(jù)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中全價(jià)配合飼料允許添加量范圍的上限配制成400 mg·L-1溶液。

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌及指示菌的培養(yǎng)

（1）凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)，參照柳成東等[25]的報(bào)道。（2）指示菌大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的培養(yǎng)，采用LB培養(yǎng)基（酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL）。指示菌產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)采用血營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、蒸餾水1 000 mL、10%的無(wú)菌脫脂纖維羊血）。（3）指示菌羅伊氏乳酸桿菌采用MRS培養(yǎng)基（蛋白胨20.0 g、酵母粉10.0 g、葡萄糖5.0 g、NaCl 2.5 g、K2HPO42.0 g、MgSO41.0 g、番 茄 汁50.0 mL、蒸餾水1 000 mL）。指示菌嗜熱雙歧桿菌采用BBL培養(yǎng)基（蛋白胨15.0 g、酵母膏粉2.0 g、葡萄糖20.0 g、可溶性淀粉0.5 g、氯化鈉5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、1.0 mL吐溫-80、肝浸粉2.0 g、蒸餾水1 000 mL）。

2.2.2 指示菌涂布平板制備

將指示菌涂布平板的MRS培養(yǎng)，于121℃滅菌30 min后冷卻至50℃，倒入培養(yǎng)皿（25.0～30.0 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

2.2.3 指示菌液稀釋涂布

（1）將培養(yǎng)24 h的豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL無(wú)菌水的EP管中，進(jìn)行梯度稀釋，選取稀釋梯度為10-4作為涂布菌液。每次操作每個(gè)指示菌涂3個(gè)培養(yǎng)皿（3次平行測(cè)定）。

（2）將培養(yǎng)24 h的羅伊氏乳酸桿菌菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL無(wú)菌水的EP管中，進(jìn)行梯度稀釋，選取稀釋梯度為10-3作為涂布菌液。每次操作每個(gè)指示菌涂3個(gè)培養(yǎng)皿（3次平行測(cè)定）。

（3）將培養(yǎng)24 h的嗜熱雙歧桿菌菌液作為涂布菌液。每次操作每個(gè)指示菌涂3個(gè)培養(yǎng)皿（3次平行測(cè)定）。

2.2.4 牛津杯法抑菌性能測(cè)定

為了統(tǒng)計(jì)比較3個(gè)處理組（無(wú)菌蒸餾水組、土霉素組、凝結(jié)芽孢桿菌組）對(duì)同一指示菌的抑制作用，每個(gè)指示菌吸取200 μL涂布一個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置3個(gè)牛津杯，分別加入100 μL的無(wú)菌蒸餾水、土霉素、凝結(jié)芽孢桿菌菌液。然后恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)。

2.3 抑菌作用的判定方法

抑菌作用的判定方法參考李靜舒等[27]的報(bào)道。為了對(duì)3個(gè)處理組的抑菌圈直徑進(jìn)行方差分析，將沒有抑制作用的抑菌圈直徑值定義為7.8 mm。并依據(jù)本試驗(yàn)所用牛津杯的直徑值（7.8 mm）將牛津杯外徑約2倍16.0 mm區(qū)分為敏感與高敏感，因此抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16.0 mm，高敏感。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

以上抑菌試驗(yàn)重復(fù)操作3次，3個(gè)處理組的DIZ數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

測(cè)定凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制情況，結(jié)果見表1和圖1。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的DIZ mm

由表1和圖1可知，該株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達(dá)到高敏感（DIZ＞16.0 mm），對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等抑制作用均為敏感（7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm）。陽(yáng)性對(duì)照組土霉素對(duì)以上指示菌的抑制作用均達(dá)到高敏感，且抑制效果顯著高于凝結(jié)芽孢桿菌（P＜0.05）。此外，陰性對(duì)照組無(wú)菌蒸餾水對(duì)以上指示菌的抑制作用均為不敏感（DIZ=7.8 mm）。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有害菌的抑制情況

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制作用

測(cè)定凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制情況，結(jié)果見表2和圖2。

由表2和圖2可知，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)羅伊氏乳酸桿菌、嗜熱雙歧桿菌的抑制作用均為不敏感；陽(yáng)性對(duì)照組土霉素對(duì)羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用達(dá)到高敏感，對(duì)嗜熱雙歧桿菌的抑制作用為不敏感。此外，無(wú)菌蒸餾水對(duì)羅伊氏乳酸桿菌和嗜熱雙歧桿菌的抑制作用均為不敏感。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的DIZ mm

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌的抑制情況

4 討論

4.1 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)腸道主要有害菌的抑制作用

雞白痢沙門氏菌是誘發(fā)家禽腸道疾病的主要致病菌之一，感染雞白痢沙門氏菌致使家禽嚴(yán)重腹瀉，顯著降低生產(chǎn)性能[28]。本研究首次證明，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)雞白痢沙門氏菌的抑制作用良好，達(dá)到敏感水平，提示該株凝結(jié)芽孢桿菌可用于家禽飼糧添加或腸道保健品預(yù)防雞白痢沙門氏菌感染。

豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌K88及K99、產(chǎn)氣莢膜梭菌等是導(dǎo)致豬雞細(xì)菌性腹瀉、死亡率高的主要致病菌，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)危害嚴(yán)重[29-31]。本研究結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)豬霍亂沙門氏菌的抑制達(dá)到高敏感水平，這與嚴(yán)濤等[32]報(bào)道一致，提示該株凝結(jié)芽孢桿菌可用于豬飼糧添加或腸道感染的治療藥物。誠(chéng)然，這一推測(cè)有待于進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K88、大腸桿菌K99和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用均為敏感，這一結(jié)果與前人報(bào)道一致[32-35]。

4.2 凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽腸道主要有益菌抑制作用

乳酸桿菌和雙歧桿菌是畜禽腸道的優(yōu)勢(shì)有益菌，對(duì)維持腸道菌群平衡、保障畜禽生長(zhǎng)性能有著重要作用[36-37]。目前，沒有體外試驗(yàn)評(píng)估凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道有益菌抑制作用的報(bào)道。鑒于以往大量文獻(xiàn)[38-39]證明飼用廣譜抗生素對(duì)畜禽腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的負(fù)面影響，本研究首次開展了凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)乳酸桿菌、雙歧桿菌的體外抑菌作用評(píng)估。本試驗(yàn)選用了腸道乳酸桿菌的代表指示菌羅伊氏乳酸桿菌以及雙歧桿菌的代表指示菌嗜熱雙歧桿菌，因?yàn)檫@兩株菌在畜禽腸道中占比較高[36-37]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)羅伊氏乳酸桿菌、嗜熱雙歧桿菌無(wú)抑制作用（不敏感）。這一結(jié)果提示飼糧使用凝結(jié)芽孢桿菌替代廣譜抗生素，能夠避免抗生素對(duì)畜禽腸道有益菌的不利影響，這可能是飼用凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)一步優(yōu)化腸道菌群、保障畜禽生產(chǎn)性能的重要機(jī)制之一。M.K.Bami等[40]研究顯示，與抑菌藥物氧化鋅比，飼用凝結(jié)芽孢桿菌有效降低肉雞腸道大腸桿菌數(shù)量，顯著增加了乳酸桿菌的數(shù)量，從而保障了肉雞正常的生長(zhǎng)性能。黃遵錫等[41]報(bào)道，與飼用抗生素組比，凝結(jié)芽孢桿菌組肉雞腸道的大腸桿菌數(shù)量顯著下降，乳酸桿菌數(shù)量顯著上升，從而保障了斷奶仔豬正常的生長(zhǎng)性能。以上體外抑菌試驗(yàn)與飼養(yǎng)試驗(yàn)檢測(cè)腸道菌群變化的結(jié)果相符，表明體外牛津杯抑菌試驗(yàn)技術(shù)適合科學(xué)、高效地選用凝結(jié)芽孢桿菌等功能性添加劑產(chǎn)品，以解決替抗類功能性添加劑在動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)中試驗(yàn)周期長(zhǎng)、可重復(fù)性差、試驗(yàn)成本高等問(wèn)題。

5 結(jié)論

本研究采用體外牛津杯法評(píng)估了一株凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)畜禽主要腸道有害菌及有益菌等7個(gè)指示菌的抑制作用，首次發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)腸道有害菌雞白痢沙門氏菌有較好抑制作用，且對(duì)腸道有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌無(wú)抑制作用。本研究體外抑菌試驗(yàn)技術(shù)可為廣大飼料企業(yè)科學(xué)、高效地選用凝結(jié)芽孢桿菌等飼用益生菌提供借鑒。