董 剛

（西豐縣郜家店動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 西豐 112400）

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患病原菌，是導(dǎo)致奶牛乳房炎較高發(fā)病率的主要原因，嚴重威脅奶牛的健康[1]。目前，臨床上防治奶牛乳房炎的主要方法仍為應(yīng)用抗生素，但抗生素的使用使金黃色葡萄球菌的耐藥性問題日益凸顯，嚴重影響著人們對綠色、健康和安全奶類食品的需求[2]。應(yīng)用中草藥替代抗生素防治金黃色葡萄球菌造成的奶牛乳房炎是目前國內(nèi)外科研學(xué)者的研究熱點。大青葉為十字花科植物菘藍的干燥葉，具有清熱解毒的功效，對大腸桿菌和枯草桿菌等具有較強的抗菌活性，而有關(guān)大青葉對金黃色葡萄球菌抗菌活性的研究報道較少[3]。因此本試驗探討了大青葉對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性，以期為奶牛乳房炎的防治提供新的思路。

1 材料

1.1 試驗藥品

大青葉，購自安徽毫州眾益堂中藥材銷售有限公司。

1.2 試驗菌株

于2017年7月份從黑龍江省某規(guī)模化養(yǎng)殖場采集患奶牛乳房炎奶牛的乳汁，并從中分離出試驗用金黃色葡萄球菌，制成凍干粉，備用。

1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯（TSB），購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂（NA），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 主要儀器設(shè)備

400Y型多功能中藥粉碎機，購自永康市鉑歐五金制品有限公司；BJ-1CD型超凈工作臺，購自北京海天友誠科技有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，購自上海申安醫(yī)療器械廠；HN-25S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自浙江力辰儀器科技有限公司。

2 方法

2.1 大青葉的預(yù)處理

應(yīng)用400Y型多功能中藥粉碎機將大青葉粉碎至60目后，置于封口袋中，備用。

2.2 大青葉水提液的制備

精密稱取大青葉粗粉50.00 g，首次浸泡1 h，用10倍量和8倍量的超純水分別煎煮提取1 h，然后用紗布過濾后合并濾液濃縮至500 mL，獲得濃度為100 mg·mL-1的大青葉水提液；將濃度為100 mg·mL-1的大青葉水提液進行流通蒸汽滅菌1 h，然后置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 試驗菌株的活化、純培養(yǎng)和平板計數(shù)

將金黃色葡萄球菌凍干粉室溫解凍后接種于TSB培養(yǎng)基中活化，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用接種環(huán)在活化的菌液中蘸取，然后在NA平板上

劃線，分離單個菌落，并對單一菌落進行純培養(yǎng)12 h。采用平板計數(shù)法對純培養(yǎng)獲得的菌液進行計數(shù)。

2.4 抗菌活性測定

參照胡立磊等[4]的方法測定大青葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。取滅菌試管7支編號，于1～7管中各加入TSB 5 mL，然后于第1支試管中加入100 mg·mL-1的大青葉水提液5 mL，混勻后取出5 mL加入第2支試管中，依此類推，直到第6支試管，從管中取出5 mL棄去，使其含藥濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg·mL-1；第7支試管為空白對照，只加入5 mLTSB，不加入大青葉水提液，然后1～6管中各加入5×106cfu·mL-1供試菌液0.1 mL，搖勻，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以不發(fā)生渾濁變化視為無細菌生長，無細菌生長的最小藥物濃度為大青葉水提液MIC值。在測定的MIC值基礎(chǔ)上將沒有發(fā)生渾濁變化的試管，接種于NA平板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)少于5個視為無細菌生長，無細菌生長的最小藥物濃度為大青葉水提液的MBC值。本試驗重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

測定大青葉水提物對金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值，見表1。

表1 大青葉提取液對金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值（n=3）

由表1可知，當(dāng)大青葉提取液的藥物濃度為3.125 mg·mL-1時，試管澄清；當(dāng)大青葉提取液的藥物濃度為6.25 mg·mL-1時，NA平板上無菌落生長，故大青葉水提取對金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值分別為3.125 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1。

4 討論

本試驗采用的提取方法為最傳統(tǒng)的水煎煮法對大青葉進行煎煮。水煎煮法比較其他的方法，相對操作簡單、易于操作，適合獸醫(yī)臨床的應(yīng)用，且研究的成本相對較低、更易于獲得結(jié)果[5]。同類型的試驗采用的方法還有醇提法和超濾提取法等，但研究方法操作較為繁瑣、研究成本相對較高，因此本研究采取了傳統(tǒng)的水煎法獲取大青葉水煎液。

大青葉具有清熱解毒、涼血消斑等多種功效，其主要具有抗病原微生物、提高機體免疫力等多種藥理作用[6]。在獸醫(yī)臨床上，大青葉可應(yīng)用于奶牛乳房炎。奶牛乳房炎主要是金黃色葡萄球菌的引起的奶牛疾病，奶牛發(fā)生乳房炎的初期主要出現(xiàn)體溫升高和乳房部炎癥，此時解表、消炎尤為重要。現(xiàn)代獸醫(yī)藥理學(xué)研究表明，大青葉中含有的多種藥用成分，如生物堿、有機酸和多糖等，且這些物質(zhì)均對金黃色葡萄球菌等細菌具有一定的抗菌活性[8]。本試驗結(jié)果顯示大青葉水提液對金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值分別為3.125、6.25 mg·mL-1，這充分證實了大青葉對金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性。

5 結(jié)論

大青葉對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，且可廣泛的應(yīng)用到金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的獸醫(yī)臨床治療上。