胡艦，朱正潔,，梁瀟瀅，王榮蘭，朱云龍*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212100)

無花果(FicuscaricaL.)，薔薇目、?？?、榕屬的多年生木本開花植物，花隱于囊狀總花托內(nèi)，外觀見果不見花，故名為無花果[1]。果皮薄且無核，食用方便，質(zhì)感松軟，味濃香甜，氨基酸含量最高可達(dá)400 mg/100 g，富含多酚、維生素C、多糖、補(bǔ)骨脂素等活性成分和多種礦物質(zhì)元素，兼具極高的營養(yǎng)和藥用價值[2]。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)，歸屬為胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木[3]，收錄于國家衛(wèi)健委公布的2019版最新藥食同源目錄。作為藥食兩用的原料，沙棘富含多種維生素、微量元素、不飽和脂肪酸以及人體所需的8種必需氨基酸，特別是維生素C的含量極高，是蘋果的數(shù)百倍，橘子的35倍，而且沙棘果實中的維生素C穩(wěn)定性極強(qiáng)[4]。此外，沙棘果實中還含有大量的黃酮類化合物、超氧化物歧化酶(SOD)、酚類活性成分等生物活性物質(zhì)，其藥用功效主要有延緩衰老、抵抗輻射、抑制血小板粘附、預(yù)防腫瘤、增強(qiáng)免疫力等，對心血管疾病也有良好的抵御效果[5]，是優(yōu)質(zhì)的保健食品原料，市場前景廣闊。

目前關(guān)于無花果和沙棘衍生食用產(chǎn)品的研究已有不少，但尚未見將二者結(jié)合生產(chǎn)復(fù)配產(chǎn)品的相關(guān)報道[6]。

本文以新鮮無花果、沙棘果為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面實驗設(shè)計，旨在探究優(yōu)化無花果沙棘復(fù)合果醋的最佳發(fā)酵工藝，生產(chǎn)一種新型的健康營養(yǎng)果醋，為無花果、沙棘資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)的同時，也為調(diào)味品市場產(chǎn)品種類的拓展提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果干：常熟神農(nóng)果業(yè)有限公司；呂梁野生沙棘果：文水縣萬家富貢梨專業(yè)合作社；高活性釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌種：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；果膠酶(食品級)：蘇州久瑞生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸(以上3種試劑純度標(biāo)準(zhǔn)為分析純)：鄭州秋雨化工有限公司；蒸餾水：實驗室自制去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

TM-767多功能食品料理機(jī) 中山市帥龍電器有限公司；SPX-70B生化培養(yǎng)箱 上?？德穬x器設(shè)備有限公司；RHZ-Q全溫空氣恒溫振蕩搖床 金壇區(qū)水北科普實驗儀器廠；TD5A-WS臺式離心機(jī) 南京曉儀儀器設(shè)備有限公司；HH-2恒溫數(shù)顯水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；SNH-CSJ實驗室超純水機(jī) 山東聚創(chuàng)環(huán)保有限公司；PHSJ-3F臺式數(shù)顯pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA224S賽多利斯電子分析天平 深圳市林濤儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點1.3.2.1 原料預(yù)處理

實驗選用新鮮成熟的無花果、沙棘果，此時果實中的含糖量和果酸含量均較高，便于微生物生長發(fā)酵。分別將鮮果洗凈后置于食品料理機(jī)中破碎成無花果汁、沙棘汁備用。

1.3.2.2 果膠酶酶解

分別在無花果汁、沙棘汁中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的果膠酶，置于水浴鍋中50 ℃酶解30 min，原因是應(yīng)用果膠酶酶解破碎果實，不僅可有效加速果汁過濾，促進(jìn)澄清，還有利于酒精發(fā)酵[7]。

1.3.2.3 離心過濾

將酶解后的無花果汁、沙棘果汁分別置于離心機(jī)中，設(shè)置條件為轉(zhuǎn)數(shù)5000 r/min，時間40 min。目的是去除果汁中的雜質(zhì)和浮油，再分別用4層紗布過濾，然后按照實驗所需比例將二者混合備用。

1.3.2.4 菌種活化

按照1 g蔗糖，20 mL蒸餾水的比例配制糖液，然后加入2 g釀酒酵母在40 ℃培養(yǎng)箱中活化1 h，注意菌種不得出現(xiàn)包心結(jié)塊的現(xiàn)象。

1.3.2.5 酒精發(fā)酵

在無菌條件下，將經(jīng)活化后的釀酒酵母接種至復(fù)合果汁中，添加量為0.2%，攪拌均勻，密封，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d制備無花果沙棘復(fù)合沙棘果酒，至酒精度不再上升即可停止發(fā)酵，其初始酒精度可用酒精計測量，初始pH值用pH計測量。

1.3.2.6 醋酸發(fā)酵

利用無水乙醇NaOH(或者HCl)溶液，按照實驗要求對復(fù)合果酒的酒精度與pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，在無菌條件下，取制備好的復(fù)合果酒每100 mL于一支250 mL三角瓶中，接入適量醋酸菌種，置于搖床上設(shè)置轉(zhuǎn)速為130 r/min，固定溫度30 ℃進(jìn)行醋酸發(fā)酵，至酸度不再上升時即可終止發(fā)酵。

1.3.2.7 過濾滅菌

將經(jīng)醋酸發(fā)酵的復(fù)合果醋用4層紗布過濾，所得原漿醋在水浴鍋中進(jìn)行巴氏滅菌，滅菌條件設(shè)置為68 ℃、20 min，經(jīng)熱灌裝即可得復(fù)合果醋成品。

1.3.3 無花果、沙棘最佳比例的確定

參照釀造食醋的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)[8]設(shè)計感官評價表，主要從外觀、滋味和氣味、組織狀態(tài)以及雜質(zhì)這4個方面對復(fù)合果醋產(chǎn)品進(jìn)行評價。設(shè)置無花果、沙棘復(fù)配的比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1(V/V)。

1.3.4 發(fā)酵工藝的確定1.3.4.1 單因素實驗

每次實驗以1000 g無花果沙棘復(fù)合果汁為基礎(chǔ)，以復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸度含量(g/dL)為評價指標(biāo)，探究醋酸菌接種量、初始沙棘果酒酒精度、初始沙棘果酒pH值和醋酸發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)數(shù)對沙棘果醋發(fā)酵的影響。設(shè)置4個因素的梯度為：醋酸菌接種量(4%、5%、6%、7%、8%)、初始酒精度(6%、8%、10%、12%、14%)、初始pH值(2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)、搖床轉(zhuǎn)數(shù)(100，110，120，130，140 r/min)。單因素實驗采用控制變量法，固定參數(shù)為：醋酸菌接種量5%、初始酒精度8%、初始pH值3.5、搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min。

1.3.4.2 響應(yīng)面設(shè)計

為確定無花果沙棘復(fù)合果醋發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數(shù)，經(jīng)單因素實驗得出醋酸菌接種量、復(fù)合果酒初始酒精度和初始pH值這3個因素對復(fù)合果醋發(fā)酵工藝較為顯著，故以這3個因素為考察變量，以復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸含量(Y)為考察指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，具體設(shè)計水平見表1。

表1 復(fù)合果醋發(fā)酵工藝響應(yīng)面設(shè)計表Table 1 The response surface design of fermentation technology of compound fruit vinegar

1.4 測定方法與數(shù)據(jù)處理

產(chǎn)品總酸含量的測定采用酸堿中和法[9]。所有實驗進(jìn)行3次平行實驗測定記錄平均值，統(tǒng)計學(xué)分析采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件，單因素制圖采用Origin 7.5，響應(yīng)面模型擬合采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果、沙棘最佳比例的確定

按實驗要求對不同比例的無花果、沙棘汁在固定的發(fā)酵條件下制作而成的復(fù)合果醋產(chǎn)品進(jìn)行感官評價，結(jié)果見表2。

表2 無花果、沙棘最佳配比的感官評價表Table 2 The sensory evaluation of the best ratio of fig and sea-buckthorn

由表2可知，不同的無花果、沙棘汁配比所制作的復(fù)合果醋感官品質(zhì)不同，當(dāng)無花果與沙棘復(fù)配比例為1∶3(V/V)時，復(fù)合果醋產(chǎn)品的感官品質(zhì)在外觀、滋味和氣味、組織狀態(tài)等方面均為最佳狀態(tài)，故確定無花果、沙棘的最佳比例為1∶3(V/V)。

2.2 發(fā)酵工藝單因素實驗

2.2.1 醋酸菌接種量對復(fù)合果醋總酸含量的影響

陳曦等[10]的研究表明，發(fā)酵最終產(chǎn)物的總酸含量受發(fā)酵時間的影響，而發(fā)酵時間又直接受菌株接種量的影響。

由圖1可知，在其他3個因素一定的情況下，復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量在醋酸菌接種量為4%～6%的范圍內(nèi)時，呈逐漸升高的趨勢，而當(dāng)醋酸菌接種量大于6%后趨于穩(wěn)定。醋酸菌接種量太小時，復(fù)合果醋的發(fā)酵時間受限，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，產(chǎn)生的乙酸量低，但是超過一定范圍后，菌體細(xì)胞的生長繁殖會消耗沙棘果中的營養(yǎng)物質(zhì)，另外一方面，從實際生產(chǎn)成本的角度考慮，也應(yīng)要求接種量要盡可能小。所以，選擇醋酸菌接種量6%為下一步響應(yīng)面實驗的中心點。

圖1 醋酸菌接種量對復(fù)合果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.2 初始酒精度對復(fù)合醋總酸含量的影響

由圖2可知，在其他3個因素一定的情況下，不同的初始酒精度對復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量影響較大，初始酒精度在4%～12%的范圍內(nèi)時，復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量呈現(xiàn)先升高后逐漸下降的趨勢。因為在乙醇含量較低時，醋酸菌作用對象有限且生長繁殖較慢，產(chǎn)酸量偏低，隨著初始酒精度由4%逐漸升高至8%，沙棘果醋的總酸含量迅速增加；而酒精度一旦超過醋酸菌的可耐受范圍，又會直接對醋酸菌的生長代謝產(chǎn)生抑制作用[11]。此外，多余的乙醇還會與乙酸發(fā)生酯化反應(yīng)。因此，選擇初始酒精度8%為下一步響應(yīng)面實驗的中心點。

圖2 初始酒精度對復(fù)合果醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.3 初始pH值對復(fù)合醋總酸含量的影響

不同菌種對pH的最適要求和耐受范圍均不同，只有選擇最適的pH值才有利于菌的生長及產(chǎn)物的生產(chǎn)，以此提高生產(chǎn)效率[12]。

由圖3可知，在其他3個因素一定的情況下，當(dāng)初始pH值在2.5～4.5范圍內(nèi)變化時，復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)pH值為3.5時，總酸含量達(dá)到最高為，6.5 g/dL。所以，綜合認(rèn)為pH為3.5時，最適宜進(jìn)行復(fù)合果醋的醋酸發(fā)酵，故而確定響應(yīng)面實驗設(shè)計中該因素值3個水平為3.0，3.5，4.0。

圖3 初始pH對復(fù)合果醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對沙棘醋總酸含量的影響

相關(guān)研究顯示：搖床轉(zhuǎn)速越高，發(fā)酵液中溶解的氧氣含量越高，二者呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而醋酸菌屬于好氧型微生物，發(fā)酵環(huán)境中的氧氣含量直接影響醋酸菌的生長代謝和發(fā)酵效率[13]。

由圖4可知，在其他3個因素一定的情況下，復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量隨搖床轉(zhuǎn)速的增加呈先逐漸升高后略有下降最后趨于平穩(wěn)的趨勢，其原因可能是轉(zhuǎn)速太高，使得醋酸發(fā)酵過于劇烈，反而不穩(wěn)定，也難以操控。與圖1～圖3對比可知，產(chǎn)品總酸含量隨搖床轉(zhuǎn)速的變化而變化的幅度最小，可認(rèn)為其影響不如其他3個因素顯著，所以不將其列入下一步的響應(yīng)面，綜合分析，確定復(fù)合果醋發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對復(fù)合果醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of shaking speed on total acid content of compound fruit vinegar

2.3 發(fā)酵工藝的響應(yīng)面擬合

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

由2.2部分的實驗結(jié)果可知，搖床轉(zhuǎn)速對復(fù)合果醋總酸含量影響的極差最小，僅為R(搖床轉(zhuǎn)速)=1.9，由此可以說明搖床轉(zhuǎn)速對最終產(chǎn)品總酸含量的影響較其他3個因素稍弱。所以選擇醋酸菌接種量(A)、初始酒精度(B)和初始pH值(C)這3個因素為自變量，以復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量(Y)為優(yōu)化實驗響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計3因素3水平的實驗，以此優(yōu)化復(fù)合果醋發(fā)酵工藝參數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experiment design and results

續(xù) 表

2.3.2 模型建立與方差分析

對Box-Behnken實驗設(shè)計組配的17組數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面擬合和統(tǒng)計學(xué)分析，可得復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸含量關(guān)于所選3個因素的擬合回歸方程：

Y(總酸含量)=7.03-0.3A+0.15B+0.096C-0.17AB-0.03AC+0.028BC-0.73A2-0.65B2-0.39C2。

利用軟件對所得的復(fù)合果醋總酸含量擬合模型進(jìn)行方差分析，具體結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合果醋總酸含量方差分析Table 4 The variance analysis of total acid content of compound fruit vinegar

由表4可知，所構(gòu)建的模型p<0.0001，表明模型極顯著，而失擬項p=0.2856，>0.05，說明失擬項不顯著(p>0.05)，模型擬合程度良好，該回歸方程可用于描述醋酸菌接種量(A)、初始酒精度(B)、初始pH值(C)和復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸含量的關(guān)系。方差分析結(jié)果顯示R2=0.9830，RAdj2=0.9611，二者接近，說明預(yù)測值與真實值相關(guān)性很高[14]。比較F值大小可得，3個因素中，對沙棘果醋發(fā)酵工藝影響的程度依次為A>B>C，其中一次項A和二次項A2、B2、C2極顯著(p<0.01)，顯著(p<0.05)的項有一次項B和交互項AB，而不顯著(p>0.05)的項是一次項C和交互項AC、BC。需要注意的是，3個因素中雖C項不顯著，但是其p值為0.065，十分接近顯著水平，這可能與實驗次數(shù)和精度有關(guān)，日后工業(yè)生產(chǎn)中需要重新考量。

2.3.3 響應(yīng)面及等高線分析

Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法目前已較多地運(yùn)用于生物培養(yǎng)基優(yōu)化、藥劑制備以及食品加工優(yōu)化中。3D響應(yīng)曲面直接顯示出了所研究的3個因素對果醋產(chǎn)品發(fā)酵工藝的影響趨勢，平面等高線圖中線與線之間的疏密度則表現(xiàn)了兩個不同因素交互對果醋發(fā)酵工藝的影響程度，3D曲面圖坡度越陡，等高線呈橢圓形且越密集，說明該項對果醋發(fā)酵工藝的影響越大[15]。各因素間的交互對果醋發(fā)酵工藝的影響見圖5。

圖5中(a)的響應(yīng)面坡度最陡峭，等高線呈橢圓形而且較為密集，說明醋酸菌接種量、初始酒精度二者的交互對復(fù)合果醋發(fā)酵工藝的影響最顯著，這與表4中pAB<0.05的結(jié)論一致。圖5中(b)和圖5中(c)的3D響應(yīng)面圖均較為平緩，等高線呈圓形而非橢圓形，說明當(dāng)初始酒精度一定時，醋酸菌接種量和初始pH值的交互作用對果醋發(fā)酵工藝的影響較??；當(dāng)醋酸菌接種量一定時，初始酒精度和初始pH值的交互作用對果醋發(fā)酵工藝的影響也較小，與表4所列回歸分析的結(jié)果相吻合。

(a)

(b)

(c)

2.3.4 復(fù)合果醋發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數(shù)及驗證

利用Design Expert 8.0軟件對回歸方程偏導(dǎo)求解，可得出果醋發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。在此工藝條件下進(jìn)行3次驗證實驗，得到果醋產(chǎn)品實際總酸含量為7.270 g/dL，較優(yōu)化之前的各組數(shù)據(jù)有顯著提升(p<0.05)，此工藝參數(shù)下模型的預(yù)測值7.339 g/dL，相對誤差僅為0.949%，不到1%。由此可以驗證本研究所得的理論生產(chǎn)模型與實際情況有較好的擬合度，能有效地反映出醋酸菌接種量、初始酒精度、初始pH值等工藝環(huán)節(jié)參數(shù)與復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸含量的關(guān)系，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)發(fā)酵型無花果沙棘復(fù)合果醋。

3 結(jié)論

本研究以新鮮無花果、沙棘果為開發(fā)原料，首先，通過感官評價法確定了二者的最佳配比，再利用單因素實驗選出了醋酸菌接種量、初始酒精度、初始pH值這3個影響相對顯著的因素，在此基礎(chǔ)上以果醋總酸含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，所得模型擬合程度良好(p<0.0001)，得出最終的最優(yōu)工藝參數(shù)為：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。生產(chǎn)過程中具體操作參數(shù)為：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1、搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。通過驗證實驗，此工藝下的復(fù)合果醋產(chǎn)品總酸含量為7.270 g/dL，較優(yōu)化之前有顯著提升(p<0.05)，產(chǎn)品感官上體現(xiàn)為醋味醇和、酸甜味協(xié)調(diào)，帶有無花果和沙棘特有的果香，開發(fā)前景廣闊。該研究不僅為優(yōu)化無花果沙棘復(fù)合果醋的發(fā)酵工藝提供了科學(xué)指導(dǎo)，也對豐富調(diào)味品市場產(chǎn)品種類提供了新的方向。