曾文丹 曹升 尚小紅 陸柳英 肖亮 嚴華兵

摘? 要：以野生黃精不定芽為材料，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、2，4-D、NAA、KT進行3因素4水平的正交設計試驗，篩選黃精增殖的最佳培養(yǎng)條件;探討不同培養(yǎng)溫度對黃精組培苗繼代增殖的影響;以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，探討不同生長素及其濃度和不同培養(yǎng)容器對組培苗生根的影響。結(jié)果表明，黃精組培苗最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA，最佳培養(yǎng)溫度為22 ℃，平均繁殖系數(shù)達6.88;最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA，平均生根率達96.2%;接種袋是黃精工廠化育苗的首選生根培養(yǎng)容器。

關鍵詞：黃精;離體快繁;叢生芽

中圖分類號：S567.23????? 文獻標識碼：A

Optimization of Rapid Propagation Technology of Polygonatum

sibiricum

ZENG Wendan1，2， CAO Sheng1， SHANG Xiaohong1， LU Liuying1， XIAO Liang1， YAN Huabing1

1. Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Lab， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： In order to establish the optimum culture condition of Polygonatum sibiricum， the adventitious buds were used as the explants and MS as the basic medium to study the effects of different culture temperature and plant growth regulators （6-BA， 2，4-D， NAA， KT） with an orthogonal experimental design L9 （34） on multiplication and plant regeneration in vitro. 1/2 MS was used as the basic medium to study the effects of different plant growth regulators and culture vessel on rooting of tissue cultured plantlets. The optimal multiplication medium was MS + 2.0 mg/L 6-BA +? 0.2 mg/L 2，4-D + 0.4 mg/L NAA. The optimal culture temperature was 22 ℃ and the average proliferation coefficient reached 6.88. The optimal rooting medium was 1/2 MS + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L IBA， and the average frequency of shoot rooting reached 96.2%. Inoculation bag was the first choice culture vessel for large-scale production of P. sibiricum.

Keywords： Polygonatum sibiricum; rapid propagation; multiple shoots

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.011

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬多年生草本植物，具有補中益氣、益腎填精、滋陰潤肺，生津補脾之功效[1-2]。目前黃精的主要繁殖方式為根莖繁殖和種子繁殖。但根莖繁殖方法不僅用種量大，且繁殖系數(shù)低;種子繁殖方法雖繁殖系數(shù)較高，但成苗時間久，一般種子繁殖移栽苗需3年時間。組織培養(yǎng)技術具有繁殖系數(shù)高、不受外界環(huán)境條件限制等特點，因此，利用植物組織培養(yǎng)技術建立黃精組培苗規(guī)?；a(chǎn)技術體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃精種苗的有效途徑。近年來，有關黃精離體快繁技術已開展部分研究。周新華等[3]利用均勻設計及其分析方法篩選出黃精不定芽增殖的最佳激素組合為1.49 mg/L KT和0.29 mg/L NAA;呂煜夢等[4]研究發(fā)現(xiàn)4.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA激素組合對三明野生黃精不定芽的誘導效果最佳;張瑜等[5]認為低濃度的TDZ對不定芽的誘導和生長有促進作用;徐紅梅等[6]研究發(fā)現(xiàn)TDZ雖有利于多花黃精愈傷組織的分化，但對分化芽的進一步生長有抑制作用，易形成葉片變厚和不規(guī)則彎曲的變態(tài)葉。孫駿威等[7]通過研究不同細胞分裂素對黃精不定芽誘導及其增殖效果的影響發(fā)現(xiàn)，ZT對不定芽誘導效果最優(yōu)，6-BA次之，KT對不定芽繼代增殖的作用效果最差。本研究以前期獲得的經(jīng)愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽為外植體材料，利用正交試驗設計方法，探討不同生長調(diào)節(jié)劑對黃精不定芽繼代增殖的影響;通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)容器，提高繁殖系數(shù)，降低生產(chǎn)成本，以實現(xiàn)黃精組培苗規(guī)?；?，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

參考呂煜夢等[4]對野生黃精無菌體系建立的方法，經(jīng)愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽為試驗材料。

激素標準品6-BA、2，4-D、NAA、KT、IBA，購自美國Sigma公司。

1.2? 方法

1.2.1? 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度對黃精組培苗繼代增殖的影響? 采用L9（34）正交設計，以MS為基本培養(yǎng)基，設置6-BA（1、2、3 mg/L）、2，4-D （0.1、0.2、0.4 mg/L）、NAA（0、0.2、0.4 mg/L）、KT（0、1.0、2.0 mg/L）作為試驗因子，每個因子設置3個水平，具體設計方法如表1所示，試驗共有9個處理。每個處理接種5瓶，每瓶接種6個外植體，重復3次。接種30 d后統(tǒng)計繁殖系數(shù)。

1.2.2? 不同培養(yǎng)溫度對黃精組培苗繼代增殖的影響? 將獲得的黃精不定芽置于3種不同培養(yǎng)溫度即22、25、28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶接種6個外植體，重復3次。接種30 d后統(tǒng)計繁殖系數(shù)并觀察植株生長情況。

1.2.3? 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度對黃精組培苗生根的影響? 將株高3～4 cm的組培苗接種于附加0.2～1.0 mg/L NAA和0.2～1.0 mg/L IBA的1/2 MS培養(yǎng)基中。每個處理接種5瓶，每瓶接種6個外植體，重復3次。接種30 d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)和平均根長，觀察植株生長情況。

1.2.4? 不同培養(yǎng)容器對黃精組培苗生根的影響? 將株高3～4 cm的組培苗分別接種于瓶裝和袋裝培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基均為1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA+ 0.2 mg/L IBA。每個處理接種5瓶，每瓶接種6個外植體，重復3次。接種30 d后統(tǒng)計生根率、根數(shù)和平均根長，觀察植株生長情況。

1.2.5? 培養(yǎng)條件? 除特殊說明外，培養(yǎng)溫度均為（22±1）℃、光照強度1500～2000 lx、光照時間為12 h/d。培養(yǎng)基均添加30.0 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂粉，pH 5.8。

1.2.6? 煉苗和移栽? 參考曾文丹等[8]煉苗及移栽方法進行黃精組培苗移栽。移栽基質(zhì)為珍珠巖︰草炭土（體積比3︰1）。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2010軟件進行整理、統(tǒng)計和分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 黃精組培苗繼代增殖的適宜培養(yǎng)基

將帶愈傷組織的不定芽轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)基，10 d后切口邊緣開展形成新的愈傷組織，20 d后愈傷組織出現(xiàn)芽點，形成新的不定芽。隨著培養(yǎng)時間的推移，不定芽葉片逐漸展開，形成植株（圖1A、圖1B、圖1C）。9種不同培養(yǎng)基誘導不定芽的繁殖系數(shù)見表1，其中以處理5獲得的繁殖系數(shù)最高（6.32），且植株長勢旺盛，葉片生長正常。根據(jù)正交試驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明， 4因素的極差值大小順序為6-BA>NAA>2，4-D> KT，即6-BA對不定芽繼代增殖的影響最大，其次為NAA，而KT對不定芽繼代增殖的影響最?。ū?）。表2方差分析結(jié)果表明，僅6-BA與不定芽繁殖系數(shù)顯著相關（P<0.05），其F值最高，為3.029。說明黃精組培苗在繼代增殖過程中，6-BA是影響黃精組培苗繁殖系數(shù)的最關鍵因素。

2.2? 黃精組培苗繼代增殖的適宜溫度

不同培養(yǎng)溫度對黃精組培苗繼代增殖的影響如表3所示，當培養(yǎng)溫度為22 ℃，繁殖系數(shù)最高，為6.88，且不定芽生長勢強，植株生長茂盛，葉片濃綠。隨著培養(yǎng)溫度的升高，繁殖系數(shù)降低，生長勢變?nèi)?，且隨著培養(yǎng)時間的推移，葉片逐漸變黃。當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，繁殖系數(shù)極顯著降低，僅為4.27，且不定芽葉片黃化現(xiàn)象嚴重。由試驗結(jié)果得知，黃精組培苗繼代增殖的最佳培養(yǎng)溫度為22 ℃。

2.3? 黃精組培苗生根適宜培養(yǎng)基

由表4可知，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，黃精組培苗均可生根。當培養(yǎng)基中單獨添加NAA時，隨著其濃度的增加，組培苗的生根率呈先增加后降低的趨勢，添加0.5 mg/L NAA時，組培苗生根率最高，為81.7%。但添加1.0 mg/L NAA時，組培苗的根數(shù)和平均根長最長，分別為5.37和1.99 cm。當培養(yǎng)基中單獨添加IBA時，組培苗也均可生根，但生根率、根數(shù)、平均根長等均小于單獨添加NAA誘導的組培苗。以培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA 2種生長素時，組培苗的生根率最高，且根數(shù)最多（圖1D、圖1E），分別為96.2%和5.53。

2.4? 黃精組培苗生根的適宜培養(yǎng)容器

由表5可知，采用組培瓶作為生根培養(yǎng)容器時，黃精組培苗的生根率、根數(shù)和平均根長雖均高于以接種袋為培養(yǎng)容器，但二者差異不顯著。接種袋具有成本低、操作簡單、空間利用率高的優(yōu)點，是工廠化育苗的首選容器。

2.5? 組培苗移栽

將所獲生根組培苗移栽至珍珠巖︰草炭土（3∶1）混合基質(zhì)中，30 d后組培苗移栽成活率達81%，其生長良好（圖1F）。

3? 討論

在植物組織培養(yǎng)工作中，激素的種類組合及其濃度是影響植物愈傷組織誘導和植株再生的關鍵性因素之一，在激素種類較多時，需選用高效快速的方法找出最佳激素組合及其濃度。正交試驗設計方法是進行植物離體快繁技術研究較簡便、快捷且行之有效的方法[9-11]。孫英坤等[12]利用正交試驗設計成功建立了瀕危物種堇葉紫金牛高效組培快繁技術體系，推測基本培養(yǎng)基類型是叢生芽誘導和壯苗培養(yǎng)的關鍵影響因子，同時也是影響組培苗生根率的決定性因子;而IBA的濃度是影響根系數(shù)量和根系長度的決定性因子。彭斯文等[13]利用正交試驗方法篩選出杜鵑蘭組培快繁的適宜培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方。陳雨露等[14]采用4因素4水平的正交設計試驗，篩選出康乃馨試管開花的最佳培養(yǎng)條件，開花率可達87%。本研究通過正交試驗探討6-BA、2，4-D、NAA和KT對黃精不定芽繼代增殖的影響發(fā)現(xiàn)，6-BA與不定芽繁殖系數(shù)呈現(xiàn)顯著相關，其F值最高，說明6-BA對不定芽繼代增殖的影響最大，NAA影響次之，KT影響最小。繼代增殖培養(yǎng)基中不添加KT有利于黃精不定芽的增殖，這與吳宇函等[15]的研究結(jié)果不同，這可能與外植體來源不同、誘導組培苗的狀態(tài)不同或黃精種源等不同有關。葉雨心等[16]研究發(fā)現(xiàn)KT和2，4-D對多花黃精愈傷組織的誘導起主要作用，說明不同植物激素在植物不同誘導階段起著主要作用。

適宜的培養(yǎng)溫度是植物在離體培養(yǎng)條件下獲得較優(yōu)分化能力的一個重要因素。不同植物適宜的培養(yǎng)溫度不同，如海三棱藨草[17]繼代增殖的適宜溫度為30 ℃，番茄[18]的為28 ℃，而馬尾松[19]、西藏虎頭蘭[20]適宜溫度為20 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)溫度高于22 ℃時，隨培養(yǎng)時間的推移，黃精組培苗葉片易衰老黃化，生長勢變?nèi)?，產(chǎn)生的愈傷組織易褐化，繁殖系數(shù)降低。這一研究結(jié)果與蘇娟等[21]的研究結(jié)果一致。研究結(jié)果表明野生黃精組培苗適宜培養(yǎng)溫度與在自然條件下喜蔭涼的自然屬性一致。

組培苗生根率的高低是能否規(guī)模化生產(chǎn)的關鍵因素之一，生長素IBA和NAA在植物分化不定根的過程中發(fā)揮著至關重要的作用。研究人員[22-24]通過探討不同生長素對黃精組培苗生根的影響發(fā)現(xiàn)，IBA比2， 4-D、NAA更適合誘導黃精組培苗生根。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NAA和IBA均能誘導黃精組培苗的生根，且NAA對不定根的誘導能力較IBA強，這與周新華等[25]的研究結(jié)果一致。當培養(yǎng)基添加0.5 mg/L NAA和0.02 mg/L IBA時，組培苗生根率最高，為96.2%。

參考文獻

[302]?? 施吉祥， 徐希明， 余江南. 黃精多糖提取工藝、結(jié)構(gòu)及藥理活性研究進展[J]. 中國野生植物資源， 2019， 38（2）： 36-42.

[303]?? 張? 嬌， 王元忠， 楊維澤， 等. 黃精屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2019， 44（10）： 1989-2008.

[304]?? 周新華， 肖智勇， 王麗云， 等. 基于均勻設計對黃精不定芽增殖培養(yǎng)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2014， 42（31）： 10909-10911.

[305]?? 呂煜夢， 徐小萍， 張舒婷， 等. 三明野生黃精無菌體系的建立[J]. 熱帶作物學報 2019， 40（8）： 1559-1564.

[306]?? 張? 瑜， 包康佳， 倪? 穗， 等. 黃精種子萌發(fā)及組培技術研究[J]. 中國野生植物資源， 2019， 38（1）： 21-26.

[307]?? 徐紅梅， 趙東利. 植物生長調(diào)節(jié)劑對多花黃精芽體外發(fā)生過程中性狀的影響[J]. 中草藥， 2003（9） ： 90-93.

[308]?? 孫駿威， 趙? 進， 周榮鑫. 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對多花黃精組織培養(yǎng)的效果[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學， 2017， 45（3）： 97-100.

[309]?? 曾文丹， 嚴華兵， 曹? 升， 等. 何首烏離體快繁技術體系的建立[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2018， 49（12）： 2494-2499.

[310]?? 唐文忠， 王小媚， 黃偉雄， 等. 應用正交試驗設計優(yōu)選番木瓜組培苗生根培養(yǎng)基研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2012， 43（11）： 1672-1675.

[311]?? 劉? 君， 黑銀秀， 朱長志， 等. 應用正交設計法優(yōu)選救心菜不定芽增殖培養(yǎng)基[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2015， 46（11）： 2015-2019.

[312]?? 宋英今， 季? 靜， 劉海學， 等. 安祖花愈傷組織誘導及其分化的正交試驗設計[J]. 核農(nóng)學報， 2008（3）： 300-303.

[313]?? 孫英坤， 胡紹慶， 龐基良， 等. 珍稀瀕危物種堇葉紫金牛高效快繁體系的建立[J]. 植物學報， 2017， 52（6）： 764-773.

[314]?? 彭斯文， 朱校奇， 黃艷寧， 等. 杜鵑蘭組培快繁基本條件研究[J]. 中國野生植物資源， 2016， 35（6）： 21-23， 26.

[315]?? 陳雨露， 彭潔平， 劉? 芳， 等. 基于正交設計的康乃馨試管苗增殖和開花誘導研究[J]. 熱帶作物學報， 2017， 38（10）： 1907-1912.

[316]?? 吳宇函， 俞涵曦， 韓曉文， 等. 多花黃精植株再生及繁殖研究[J]. 種子， 2019， 38（7）： 90-95.

[317]?? 葉雨心， 任夢婷， 易偉豪， 等. 多花黃精誘導愈傷組織與不定芽培養(yǎng)基篩選[J]. 亞熱帶植物科學， 2019， 48（1）： 84-87.

[318]?? 張? 群， 呂秀立， 何小麗， 等. 海三棱藨草的組織培養(yǎng)與快繁體系[J]. 植物學報， 2016， 51（5）： 684-690.

[319]?? Bhatia P， Ashwath N， Senaratna T， et al. Tissue culture studies of tomato （Lycopersicon esculentum）[J]. Plant Cell ，Tissue and Organ Culture， 2004， 78（1）： 1-21.

[320]?? 姚瑞玲， 王? 胤. 溫度對馬尾松組培單芽不定根發(fā)生的影響[J]. 廣西植物， 2016， 36（11）： 1282-1287.

[321]?? 袁? 芳， 宋凱杰， 蔡熙彤， 等. 西藏虎頭蘭高效植株再生體系的研究[J]. 廣西植物， 2019， 39（4）： 482-489.

[322]?? 蘇? 娟， 張萬巧， 王? 曉， 等. 滇黃精組培褐化影響因素研究[J]. 亞熱帶植物科學， 2019， 48（2）： 201-203.

[323]?? 何? 艷， 朱玉球， 肖? 波， 等. 多花黃精組織培養(yǎng)體系的研究[J]. 中國中藥雜志， 2019， 44（10）： 2032-2037.

[324]?? 莫勇生， 盧拓方， 邱展鴻， 等. 多花黃精組培苗快速繁殖體系建立研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2018， 20（4）： 445-449.

[325]?? 劉紅美， 方小波， 夏開德， 等. 多花黃精組織培養(yǎng)快繁技術的研究[J]. 種子， 2010， 29（12）： 13-17.

[326]?? 周新華， 朱宜春， 桂尚上， 等. 多花黃精組培生根技術研究[J]. 經(jīng)濟林研究， 2015， 33（4）： 102-105.

責任編輯：崔麗虹