鞏潤澤，胡海燕

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233

骨肉瘤是一種來自于骨的原發(fā)惡性腫瘤，占骨原發(fā)腫瘤的56%，發(fā)病率約為3/105，發(fā)病年齡在10～14歲［1-3］，臨床表現(xiàn)以患處的疼痛、腫脹以及病理性骨折為主。大多數(shù)骨肉瘤患者只存在單一病變，最常見的是肢體骨肉瘤，尤其是股骨遠端，其他常見部位依次是近側(cè)脛骨的干骺端和肱骨近端、頭頸部、脊柱及骨盆。值得注意的是，近10%～20%的患者因轉(zhuǎn)移灶被確診。常見的部位是肺（85%），其次是骨骼（8%～10%），偶爾也有淋巴結(jié)［4］。其余80%～90%的患者可考慮具有亞臨床轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移，目前無法準確檢測［5］。手術(shù)聯(lián)合大劑量、密集、多藥序貫化療為骨肉瘤標準治療方法，與單純手術(shù)治療相比，患者的保肢率、生存率獲得了大幅提高［6］。然而，伴有轉(zhuǎn)移的患者生存率仍不容樂觀［7］。腫瘤微環(huán)境與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CC族趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）是一種與腫瘤密切相關(guān)的趨化因子，通過識別CC族趨化因子受體2（CC chemokine ligand receptor 2，CCR2），調(diào)節(jié)免疫細胞向腫瘤的遷移［7］。轉(zhuǎn)移相關(guān)的巨噬細胞在細胞表面表達高水平的CCR2。CCL2與CCR2的結(jié)合促進巨噬細胞招募到轉(zhuǎn)移位點，從而加速癌細胞的播散和擴張。CCL2可以增加乳腺癌、腸癌、肺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲性［8-10］。本研究在單細胞測序分析骨肉瘤微環(huán)境時發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞高表達CCL2，進而通過組織芯片分析CCL2表達與預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2017年1月—2019年12月收治的11例骨肉瘤患者手術(shù)切除的骨肉瘤組織和80例（90例的組織芯片，10例因有組織脫落未納入分析）采用骨肉瘤原發(fā)灶石蠟包埋組織制備的組織芯片。本研究為回顧性分析，經(jīng)上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 單細胞測序

應(yīng)用GEXSCOPE?組織解離液［新格元（南京）生物科技有限公司］將11例骨肉瘤組織解離成單細胞懸液，使用鉻控制器（美國10x Genomics公司）將單個細胞封裝成乳狀液滴。使用美國10x Genomics公司的試劑盒（Chromium Single Cell Gene Expression Kit、Gel Bead Kit及Multiplex Kit）并按照說明書構(gòu)建單細胞RNA測序（single cell RNA sequence，scRNA-seq）文庫。在ChromiumTM控制儀中將細胞分成乳狀液中的凝膠珠，裂解細胞并進行RNA條形碼反轉(zhuǎn)錄。利用Nextera XT DNA sample Pre-Kit（美國Illumina公司）擴增的cDNA構(gòu)建測序文庫，并使用高靈敏度DNA試劑盒在安捷倫生物分析儀（美國Agilent Technologies公司）上評估個體樣本的最終文庫。在Illumina HiSeq X測序平臺上收集75個周期運行試劑盒進行測序，每個試劑盒具有150 bp的配對端reads。使用Read10×()函數(shù)對具有個體樣本基因表達數(shù)據(jù)的Seurat對象進行處理。對于每個樣本，將基因表達量表示為該基因的百分數(shù)乘以10000，轉(zhuǎn)換為自然對數(shù)，加1后歸一化，避免取對數(shù)0。從歸一化表達矩陣中篩選出前3000個高變異基因，居中并按比例進行主成分分析（principal component analysis，PCA）?；谇?0個PCA成分，采用R Harmony軟件包（1.0版）消除批處理效果。

1.3 免疫組織化學檢測

免疫組織化學檢測采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（strept-avidin-biotinperoxidase complex，SABC）法進行染色，步驟參考試劑盒說明書。兔抗人CCL2抗體（ab8101，英國Abcam公司）濃度為1∶100，山羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶500。免疫組織化學試劑盒及二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，CCL2為細胞質(zhì)陽性。免疫組織化學評分=染色強度評分×陽性區(qū)染色比例評分。

顏色強度：不著色0分，弱著色1分，中著色2分，強著色3分。陽性細胞百分率0～5%計0分，陽性率6%～25%計1分，陽性率26%～50%計2分，陽性率51%～74%計3分，陽性率≥75%計4分。陽性染色主要位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中。最終結(jié)果以染色強度和染色范圍評分的乘機表示：陰性為0分，弱陽性為1～4分，陽性為5～8分，強陽性為9～12分，取中位值分為高表達組＞5.97分，低表達組≤5.97分。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SSPS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，以CCL2蛋白表達的免疫組織化學評分中位數(shù)劃分定義高、低表達組，以患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及復發(fā)作為協(xié)變量，進行多因素方差分析（COX回歸分析）。Kaplan-Meier法計算生存率，差異性分析采用 log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 單細胞分析骨肉瘤細胞CCL2表達

基于R Harmony與Louvain算法我們定義了骨肉瘤的腫瘤細胞，將測序數(shù)據(jù)植入Seurat包的“FindClusters”函數(shù)后，用t-SNE方法在二維地圖上顯示識別出的聚類，閾值設(shè)定為3，CCL2呈高表達（圖1）。

圖1 單細胞分析11例骨肉瘤細胞CCL2表達Fig.1 Single cell analysis of CCL2 expression in 11 samples of osteosarcoma cells

2.2 骨肉瘤組織中CCL2的表達與臨床病理特征分析及免疫組織化學檢測

CCL2表達高低與骨肉瘤患者臨床病理學特征分析結(jié)果見表1，CCL2的表達評分與患者的年齡、性別、腫瘤大小、化療壞死率、病理學類型間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與臨床分期及有無轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 骨肉瘤組織中CCL2的表達與臨床病理特征分析Tab.1 The correlation between CCL2 expression and clinical features of osteosarcoma patients

根據(jù)免疫組織化學結(jié)果的評分標準將80例骨肉瘤原發(fā)灶的組織芯片評分按方法描述的公式計算出來并取中位值，患者被分為低表達組和高表達組（5.29±0.95vs11.45±4.24）（圖2）。

圖2 免疫組織化學SABC法分析骨肉瘤組織CCL2表達Fig.2 Immunohistochemical analysis of CCL2 expression in osteosarcoma by SABC method

2.3 生存分析

本研究的隨訪時間為12～36個月，80例患者中31例因死亡而終止隨訪，其余患者至終點時仍生存。經(jīng)Kaplan-Meier生存統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，CCL2高表達組患者的總生存率較低表達組患者組低（P=0.042，圖3）。

圖3 Log-rank檢驗分析骨肉瘤組織CCL2表達與生存率分析Fig.3 Analysis of CCL2 expression and survival rate in osteosarcoma by log-rank test

3 討論

骨肉瘤的發(fā)生率呈雙峰分布模式：在10～ 14歲（青春期發(fā)育階段）出現(xiàn)第一次發(fā)病高峰，然后在60歲后出現(xiàn)第二次發(fā)病高峰。骨肉瘤的病因尚不清楚，基因組異質(zhì)性高，目前尚未找到驅(qū)動基因，報告較多的突變基因包括定位于染色體13q14的Rb基因和定位于染色體17p13的p53基因。在20世紀70年代，骨肉瘤的標準治療方式是截肢，但5年生存率＜20%。20世紀80年代大劑量化療藥物引入術(shù)前新輔助和術(shù)后輔助化療使骨肉瘤患者的5年生存率提高到65%～70%。但伴發(fā)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率仍然≤25%［11］。

骨肉瘤細胞與周圍腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）之間的交流是腫瘤生長和隨后轉(zhuǎn)移所必需的。TME的主要影響成分是腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM），它是參與炎癥反應(yīng)和組織穩(wěn)態(tài)的免疫細胞。我們前期應(yīng)用單細胞技術(shù)分析了骨肉瘤組織及免疫微環(huán)境的異質(zhì)性［12］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細胞CCL2高表達。與原發(fā)性骨肉瘤相比，在肺轉(zhuǎn)移瘤中發(fā)現(xiàn)了更高比例的M2型TAM，這與促炎分子導致腫瘤侵襲能力增加有關(guān)。TAM尤其是M2型TAM的浸潤增加長期以來一直與各種腫瘤，包括骨肉瘤預(yù)后不良有關(guān)［13］。CC族趨化因子是趨化因子超家族中的一個亞家族（包括4個小鼠源趨化因子CCL6、CCL9、CCL10和CCL12），是細胞間信號轉(zhuǎn)導的組成部分，對腫瘤微環(huán)境的功能至關(guān)重要。在大多數(shù)實體瘤中，這突出了其在癌組織中作為潛在的診斷和預(yù)后生物標志物的價值。許多CC族趨化因子是多種受體的配體，CCL2即單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），其受體包括CCR1、CCR2、CCR3、CCR4和CCR5，募集單核細胞包括巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、T細胞和NK細胞。但不同的腫瘤組織內(nèi)CCL2的作用不同，在乳腺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤中，CCL2是預(yù)后不良指標［14］。腫瘤細胞CCL2的表達可能在生長因子、放療、缺氧及化療的刺激下分泌增加。由腫瘤細胞分泌的CCL2還通過激活細胞外信號轉(zhuǎn)導通路提高腫瘤細胞自身的侵襲能力，促進腫瘤細胞遷移［15］。CCL2還能通過其受體CCR2介導TAM和骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）進入腫瘤區(qū)，CCL2也是M2型巨噬細胞極化的因素之一。它還可以招募CCR2表達的Treg亞群［16］、輔助型T細胞 Th17［17］。Qian等［18］使用小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型對CCL2進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL2會有效地募集炎癥單核細胞，進而促進小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。Wang等［19］對268例非轉(zhuǎn)移性透明細胞腎細胞癌患者術(shù)后取得的組織芯片進行CCL2免疫組織化學染色并評分，然后結(jié)合患者的生存信息進行預(yù)后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL2高表達患者的10年生存率要明顯低于CCL2低表達患者。本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測了骨肉瘤組織芯片的CCL2表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達CCL2的患者3年生存率低于低表達組患者，CCL2表達與臨床分期及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究和上述其他瘤種的研究一致，表明腫瘤細胞可以分泌CCL2，募集以巨噬細胞為主的單核細胞，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。

總之，CCL2在骨肉瘤轉(zhuǎn)移的過程中起著重要作用，對預(yù)測骨肉瘤患者預(yù)后有著重要的意義。本研究結(jié)果顯示，CCL2與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但具體機制仍有待進一步研究。