曹達(dá)龍，朱文愷，施國海，張海梁，王子良，葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

前列腺癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。2021年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌位居歐美男性新發(fā)惡性腫瘤之首，同時亦是男性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因［1］。在中國，前列腺癌的發(fā)病率近年來呈快速增長態(tài)勢［2］。前期研究［3-4］顯示，前列腺癌抗原3（prostate cancer antigen 3，PCA3）顯著高表達(dá)于前列腺癌中并能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖；鑒于PCA3嵌在PRUNE2基因內(nèi)含子6中以及它們的轉(zhuǎn)錄方向正好相反，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PRUNE2基因受PCA3的負(fù)向調(diào)控。既往研究［5］證實，PRUNE2還是成神經(jīng)細(xì)胞瘤的一個特異性預(yù)后相關(guān)基因，在調(diào)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞分化、增殖和侵襲方面發(fā)揮著重要作用。前期研究［4］還發(fā)現(xiàn)，在激素抵抗型前列腺癌患者癌組織中檢測到PRUNE2 E370K突變，突變后其表達(dá)的蛋白在該位點的氨基酸殘基由谷氨酸（E）變成了賴氨酸（K），這可能引起該區(qū)域空間結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化，進(jìn)而調(diào)控其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化。本研究擬探索此位點突變對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期發(fā)現(xiàn)前列腺癌診治及預(yù)后評估的新靶點。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌DU145細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將DU145細(xì)胞置于培養(yǎng)基中于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，攜帶野生型和突變型PRUNE2基因的質(zhì)粒購自上海毅樂生物科技有限公司，凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，PRUNE2抗體（ab80262）、E-cadherin抗體（ab40722）、cyclin D1抗體（ab134175）、Bcl-2抗體（ab692）、FAK抗體（ab131435）、ROCK抗體（ab134181）和RhoA抗體（ab187026）購自英國Abcam公司，β-actin內(nèi)參抗體購自美國Proteintech公司，兔源和鼠源熒光二抗購自美國Jackson實驗室，免疫共沉淀用磁珠購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 包裝病毒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選生長狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞。將目的質(zhì)粒10 μg和包裝質(zhì)粒（pRSV-Rev、pMD2.G、pMDLg/pRRE和pCDH-puro）在1.5 mL Ependorf試管中混勻，RPMI-1640培養(yǎng)基定容至 500 μL；在另一個1.5 mL Ependorf試管中加入 25 μL LipofectamineTM2000/LipofectamineTM3000，用RPMI-1640培養(yǎng)基定容至500 μL；將兩者混合后加入HEK-293T細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。36～48 h后收取HEK-293T細(xì)胞上清液，用0.45 μm過濾器過濾后分裝入1.5 mL Ependorf試管中（用于感染目的DU145細(xì)胞），-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒋腥镜腄U145前列腺癌細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入2 mL所收集的慢病毒顆粒至每孔中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后更換成完全培養(yǎng)基。期間，定期觀察細(xì)胞狀態(tài)，等到細(xì)胞快要長滿時將其接種至 25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。最后，在細(xì)胞達(dá)到80%豐度時加入嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選。

1.4 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

實驗分成兩組：一組為PRUNE2野生型（對照組），另一組為PRUNE2突變型（實驗組），均設(shè)置6個平行孔。按照10000個/孔（100 μL）的密度將實驗組和對照組細(xì)胞分別接種到96孔板中，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后分別在第1、2、3、4和5天的同一個時間點，按照10 μL CCK-8檢測試劑/100 μL培養(yǎng)基的比例加入CCK-8檢測試劑，培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的各孔吸光度（D）值。根據(jù)所得D值進(jìn)行比較、作圖。實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞克隆形成實驗

按照400個/孔的比例將處于對數(shù)生長期的實驗組和對照組細(xì)胞分別鋪于6孔板內(nèi)（每組設(shè)置3個平行孔），放置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，共2周。培養(yǎng)過程中每3～4 d觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)細(xì)胞生長情況換細(xì)胞培養(yǎng)基?？寺?shù)達(dá)20～30個時棄上清液，用PBS小心浸洗2遍。隨后依次使用4%多聚甲醛1 mL/孔固定30 min，使用0.5%結(jié)晶紫在室溫下固定0.5 h，PBS洗3遍后在空氣中晾干后進(jìn)行拍照，計算細(xì)胞的克隆數(shù)目并進(jìn)行比較。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞（分為實驗組和對照組），使用胰酶消化細(xì)胞，離心（每次800×g離心5 min），PBS重懸細(xì)胞。用4 ℃預(yù)冷的PBS洗2次。加入250 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至5 mL流式管中，然后依次加入5 μL Annexin Ⅴ/PE和10 μL 7-AAD，混勻（注意避光），在室溫下讓其反應(yīng)15 min。加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，混勻后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。保存圖片，記錄早期凋亡和晚期凋亡比例，分析并作圖。

1.7 侵襲、遷移實驗

細(xì)胞侵襲和遷移能力的評價采用transwell小室法。使用無血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋 60 μL的Matrigel基質(zhì)膠，然后加入到transwell小室上層，放置8 h，備用。實驗分成兩組：一組為PRUNE2野生型，作為對照組；另一組為PRUNE2突變型，作為實驗組，均設(shè)置3個平行孔。將稀釋于200 μL無血清培養(yǎng)基中的15000個實驗組或?qū)φ战M細(xì)胞分別接種在不同transwell小室的上層。然后將它們分別放至在含有750 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后，依次將小室轉(zhuǎn)移到含有4%多聚甲醛的24孔板中固定30 min，以及轉(zhuǎn)移到含0.5%結(jié)晶紫的24孔板中固定0.5 h（室溫下），再用PBS洗3遍。隨后擦去小室的上層細(xì)胞，然后在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并拍照，實驗重復(fù)3次。遷移能力的檢測：與侵襲能力檢測不同的是，transwell小室上層不加Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟相同。實驗重復(fù)3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測PRUNE2蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)情況

PRUNE2是Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)控因子之一，Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移過程。按照Western blot的標(biāo)準(zhǔn)流程檢測PRUNE2蛋白以及與該通路和細(xì)胞增殖、侵襲、遷移相關(guān)蛋白（E-cadherin、cyclin D1、Bcl-2、FAK、ROCK和RhoA）的水平。

1.9 免疫熒光實驗

先將滅菌的圓形蓋玻片置入24孔板中，然后每孔鋪50000個細(xì)胞，分成兩組：一組為PRUNE2野生型，作為對照組；另一組為PRUNE2突變型，作為實驗組，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。第2天，PBS洗凈后每孔加入300 μL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min。PBS洗凈后轉(zhuǎn)移至冰上操作，每孔加入300 μL預(yù)冷的含0.1%Triton X-100的1%BSA，室溫封閉1.5 h。PBS洗凈后每孔加入200 μL不同種屬來源的一抗，4 ℃搖床上溫育過夜。PBS洗凈后每孔加入200 μL按比例稀釋的不同種屬來源的帶有不同熒光標(biāo)記的二抗，注意避光。PBS洗凈后用鑷子/針尖小心將蓋玻片取出，用吸水紙吸去背面及邊緣水分，有細(xì)胞附著的面朝下貼在載玻片上，4 ℃溫育15 min。隨后在激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光檢測，拍照，圖片處理。

1.10 免疫共沉淀

培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞至狀態(tài)良好，PBS清洗后加入預(yù)冷的RIPA緩沖液（已事先加入蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑），用細(xì)胞刮子將細(xì)胞收集到Ependorf試管中。冰上溫育45 min，期間每8～ 10 min振蕩器混勻1次，16000×g離心15 min，取上清液（取其中的10～20 μL，用于Input實驗）。余下的樣品，分成兩部分，分別加入含事先用RIPA緩沖液清洗過的磁珠的Ependorf試管中。一管加入10 μL誘餌蛋白抗體（如PRUNE2抗體或RhoA抗體），另一管加入10 μL IgG抗體，做好標(biāo)記。4 ℃，搖床，溫育過夜。各組含樣品的Ependorf試管放入磁力架，棄上清液。加入 400 μL預(yù)冷的RIPA緩沖液，搖床旋轉(zhuǎn)清洗，5 min，放入磁力架，棄上清液，如此反復(fù)清洗5次。加入RIPA緩沖液48 μL重懸，再加入16 μL 4×SDS上樣緩沖液，95 ℃煮10 min。冷卻，離心（6000×g離心5 min），放入磁力架，收集上清液。使用Western blot檢測上述上清液中誘餌蛋白是否與目的蛋白結(jié)合。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

該實驗所涉及的統(tǒng)計學(xué)問題采用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理。本研究中所涉及的組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRUNE2 E370K突變體對DU145細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力的影響

前期我們在91例激素抵抗型前列腺癌患者癌組織中檢測到10例癌組織中存在PRUNE2 E370K突變，即第370位氨基酸殘基由酸性氨基酸——谷氨酸（E）變成了堿性氨基酸——賴氨酸（K），這可能引起該區(qū)域空間結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化，進(jìn)而調(diào)控其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化。通過慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方式，將PRUNE2野生型和PRUNE2 E379K突變型慢病毒質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而觀察PRUNE2 E370K突變體對細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響。CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第3～5天時，PRUNE2 E370K突變體組細(xì)胞較對照組細(xì)胞的生長趨勢明顯加快，即PRUNE2 E370K突變體能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖（P＜0.05，圖1A）。隨后，利用克隆形成實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PRUNE2 E370K突變體細(xì)胞的克隆形成能力也顯著高于陰性對照組細(xì)胞（P＜0.05，圖1B）。同時，利用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)PRUNE2 E370K突變體相較于對照組能夠抑制細(xì)胞的凋亡（P＜0.05，圖1C）。這些結(jié)果均表明PRUNE2 E370K突變體能夠促進(jìn)DU145細(xì)胞的惡性增殖能力。

通過侵襲和遷移能力的檢測，我們發(fā)現(xiàn)PRUNE2 E370K突變體細(xì)胞的侵襲能力較對照組顯著升高（P＜0.05，圖1D），PRUNE2 E370K突變體細(xì)胞遷移能力亦顯著升高（P＜0.05，圖1D）。這些結(jié)果表明，PRUNE2 E370K突變體與前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力密切相關(guān)。

圖1 PRUNE2 E370K突變體促進(jìn)前列癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲和遷移Fig.1 Mutant-type PRUNE2 E370K promoted malignant proliferation,invasion and migration of prostate cancer cells

2.2 PRUNE2 E370K突變體失去對Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)

PRUNE2 基因位于9 號染色體，可通過BNIPXL抑制RhoA以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而成為Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子，而Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過程。通過檢測PRUNE2野生型和突變型蛋白以及與Rho通路和細(xì)胞增殖、侵襲、遷移相關(guān)蛋白水平后發(fā)現(xiàn)，PRUNE2 E370K突變體促進(jìn)Rho下游ROCK蛋白和FAK蛋白的表達(dá)，以及促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)的Bcl-2和cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時抑制與侵襲、遷移相關(guān)抑制蛋白E-cadherin的表達(dá)（圖2A）。為了進(jìn)一步驗證PRUNE2與Rho通路的關(guān)系，通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，PRUNE2與Rho通路中關(guān)鍵蛋白RhoA之間存在共定位（圖2B）。隨后，進(jìn)一步通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)PRUNE2與RhoA之間可以相互結(jié)合，但是PRUNE2 E370K突變體與RhoA之間的相關(guān)作用明顯減弱（圖2C和2D）。這些結(jié)果表明，PRUNE2 E370K突變體蛋白喪失對RhoA蛋白的結(jié)合能力，從而失去了對Rho下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲和遷移。

圖2 PRUNE2 E370K突變體通過Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)前列癌進(jìn)展Fig.2 Mutant-type PRUNE2 E370K promoted the progression of prostate cancer through Rho signaling pathway

3 討論

既往的研究發(fā)現(xiàn)，PRUNE2是成神經(jīng)細(xì)胞瘤的一個特異性預(yù)后基因，在調(diào)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞分化、增殖和侵襲方面發(fā)揮著重要作用［5］。在前列腺癌領(lǐng)域，有研究［6］發(fā)現(xiàn)，PCA3通過ADAR依賴的腺苷到肌苷的RNA編輯機(jī)制與PRUNE2形成PRUNE2/PCA3雙鏈RNA調(diào)控PRUNE2的表達(dá)，以及在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)PRUNE2會增強(qiáng)細(xì)胞增殖，這表明PRUNE2可能是前列腺癌進(jìn)展的重要調(diào)控因子之一。進(jìn)一步研究PRUNE2介導(dǎo)前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)前列腺癌新的診治靶點。

基因多態(tài)性不僅是個體間表型差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，同時也是個體對常見疾?。ㄈ鐞盒阅[瘤）遺傳易感性差異的主要來源。近年來，基因多態(tài)性，尤其是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），已被用作遺傳標(biāo)記來廣泛地研究個體對常見疾病易感性、其對疾病進(jìn)展的影響以及對治療的反應(yīng)［7-8］。已有研究［9］發(fā)現(xiàn)，18%的甲狀旁腺癌中存在PRUNE2突變。我們前期研究顯示，激素抵抗型前列腺癌組織中存在PRUNE2 E370K突變。進(jìn)一步分析PRUNE2基因的功能區(qū)域可知，第370位氨基酸殘基由酸性氨基酸——谷氨酸（E）變成了堿性氨基酸——賴氨酸（K），這可能引起該區(qū)域空間結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化，進(jìn)而調(diào)控其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，PRUNE2 E370K突變體相較于對照組能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及抑制細(xì)胞凋亡。因此，進(jìn)一步深入研究PRUNE2突變體介導(dǎo)前列腺癌惡性增殖、侵襲、遷移的機(jī)制，可以為尋找新的前列腺癌干預(yù)靶點提供線索。

由于PRUNE2蛋白擁有BNIP2和Cdc42GAP同源結(jié)構(gòu)域，故其還能通過BNIPXL抑制RhoA以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而成為Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子［10］。隸屬于Ras超家族的Rho蛋白又稱為Rho GTP酶，尤其是RhoA、Rac1和Cdc42，它們又是調(diào)控細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞與基質(zhì)黏附及細(xì)胞骨架重組的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的過程［11-14］。同時，有研究［15-16］顯示，Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠驅(qū)動前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，PRUNE2與Rho通路中關(guān)鍵蛋白RhoA之間存在相互作用，以及相較于PRUNE2野生型PRUNE2 E370K突變體與RhoA之間的相關(guān)作用明顯減弱。PRUNE2 E370K突變體上調(diào)Rho下游ROCK蛋白和FAK蛋白的表達(dá)，以及與細(xì)胞增殖相關(guān)的Bcl-2和cyclin D1蛋白的表達(dá)，同時抑制與侵襲、遷移相關(guān)抑制蛋白E-cadherin的表達(dá)。這些結(jié)果表明，PRUNE2 E370K突變體蛋白可能因為與RhoA蛋白結(jié)合減弱，從而失去了對Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。