許景涵，左俊榮，韓楚儀，李婷婷，金冬霞，趙福梅，叢洪良△

動脈粥樣硬化是冠狀動脈疾病和腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。在動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上，急性血栓形成導(dǎo)致血管閉塞引起的心肌梗死和腦卒中是全球范圍內(nèi)最常見的死亡原因［1-2］。動脈粥樣硬化由多種因素引起，其確切發(fā)病機制仍不完全清楚。脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可通過血凝素低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）調(diào)控表面黏附分子表達，進而影響內(nèi)皮細胞功能，加速內(nèi)皮損傷，形成動脈粥樣硬化斑塊，誘發(fā)動脈粥樣硬化性心腦血管疾?。?-5］。

人類枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9（PCSK9）是原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin家族的成員，編碼神經(jīng)細胞凋亡調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酶1，與家族性常染色體顯性高膽固醇血癥有關(guān)［6］。PCSK9可通過降低肝細胞上低密度脂蛋白受體（LDLR）的數(shù)量，升高低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，導(dǎo)致高膽固醇血癥［7-8］。有研究證實PCSK9抑制劑可通過降低脂蛋白a水平來降低靜脈血栓的發(fā)生風(fēng)險［9］。其還可阻斷LDLR，降低LDL-C水平，起到抗動脈粥樣硬化的作用。但是否還具有抗炎、減輕內(nèi)皮細胞凋亡、改善血管內(nèi)皮的功能，目前尚不完全明確。本研究采用ox-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）建立細胞損傷模型，予以不同濃度PCSK9抑制劑處理，旨在探討PCSK9抑制劑對炎癥反應(yīng)及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HUVECs細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自Meilunbio公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit（RR037A）、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（RR820L）、RNAiso Plus（9109）均購自日本TaKaRa公司。ECL發(fā)光液（B500014）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。PCSK9抗體（ab181142）購 自英國Abcam公 司，Bax抗體（YM3619）、Bcl-2抗體（YM3041）、Cleaved-Caspase-3抗體（YM3431）和GAPDH抗體（YM3215）均購自北京Immunoway公司。核因子（NF）-κB抗體（ABP51957）和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）抗體（ABP50369）均購自Abbkine公司。IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ox-LDL（H7980）、胞漿蛋白和核蛋白提取試劑盒均購自北京Solarbio公司，PCSK9抑制劑（S7976）購自selleck公司。白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α和單核細胞趨化蛋白（MCP）-1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組HUVECs置于含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)并于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育；然后使用0.3%的胰酶消化并進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，分為Control組（僅更換培養(yǎng)基），ox-LDL組（50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)24 h），低、中、高劑量PCSK9抑制劑組（分別用5、10、20 μmol/L PCSK9抑制劑預(yù)處理24 h，再加入50 mg/L ox-LDL誘導(dǎo)24 h），每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性 細胞分組處理24 h后，每孔加入新鮮配制的含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測各組細胞在450 nm的光密度（OD）值。計算細胞存活率＝（實驗組OD/對照組OD）×100%，并繪制細胞生長存活率曲線。

1.2.3 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和MCP-1的含量 收集各組細胞培養(yǎng)液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α和MCP-1的含量。

1.2.4 qPCR檢測細胞中IL-6、TNF-α和MCP-1的轉(zhuǎn)錄水平 收集各組處理好的細胞，經(jīng)PBS洗滌3次，加入1 mL Trizol裂解液提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR反應(yīng)。PCR體系：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX reference Dye 0.4 μL，滅菌水6 μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；熔解曲線：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 取處理好的細胞，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶消化細胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化。500×g離心5 min，棄上清液，細胞收集到管底；結(jié)合緩沖液重懸細胞。取100 μL細胞懸液（約1×105個細胞），加入5 μL Annexin V和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。孵育完成后，每管加入400 μL結(jié)合緩沖液，混勻后使用流式細胞儀檢測（1 h內(nèi)檢測完畢）。

1.2.6 Western blot檢 測Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、PCSK9、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達 收集處理好的細胞，吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液裂解細胞并提取總蛋白。根據(jù)胞漿蛋白和核蛋白提取試劑盒說明書分別進行胞漿蛋白、核蛋白提取。采用BCA試劑盒檢測細胞中蛋白濃度，統(tǒng)一上樣30 μg進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳條件：80 V 30 min，然后120 V 2 h。電泳結(jié)束后17 V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min，之后室溫5%脫脂牛奶封閉3 h，TBST洗膜后添加Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、PCSK9、NF-κB、p-NF-κB和GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜；次日TBST洗膜3次，加入二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育2 h后TBST洗膜3次。在暗室中使用ECL顯影曝光，掃描軟件進行圖像采集，Image J軟件分析灰度值并計算目的蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較時方差齊行LSD-t法，方差不齊行Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率比較 與Control組比較，ox-LDL組HUVECs存活率明顯下降；與ox-LDL組相比，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，HUVECs存活率升高（P＜0.05），見圖1。

2.2 各組細胞TNF-α、IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平變化 與Control組比較，ox-LDL組細胞炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平增加（P＜0.05）。與ox-LDL組相比，中、高劑量PCSK9抑制劑處理細胞IL-6、TNF-α和MCP-1轉(zhuǎn)錄及分泌水平明顯下降，低劑量組IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，見表2。

Fig.1 Changes of cell activity in each group圖1各組細胞存活率變化

2.3 各組細胞凋亡水平比較Control組，ox-LDL組，低、中、高劑量PCSK9抑制劑組細胞凋亡率分別為（3.07±0.91）%、（34.25±3.19）%、（23.80±2.84）%、（15.67±2.25）%、（8.93±1.62）%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=56.560，P＜0.01）。與Control組比較，ox-LDL組中細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，PCSK9抑制劑處理的細胞凋亡率均降低，中、高劑量PCSK9抑制劑組凋亡率降低更為明顯（P＜0.05），見圖2。

2.4 各組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平變化 與Control組 比 較，ox-LDL組 細 胞 促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3的表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)，p-NF-κB水平升高（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，Bax和Cleaved-Caspase-3表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)，同時p-NF-κB水平降低（P＜0.05）。見表3、圖3。

2.5 各組細胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達變化 與Control組比較，ox-LDL組細胞核中NF-κB表達上調(diào)，胞質(zhì)中表達下調(diào)（P＜0.05）。與ox-LDL組比較，中、高劑量PCSK9抑制劑處理后，HUVECs細胞質(zhì)中NF-κB表達上調(diào)，細胞核NF-κB表達下調(diào)（P＜0.05），見表4、圖4。

Tab.2 Changes of TNF-α,IL-6 and MCP-1 proteins and their gene levels in each group表2各組細胞中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白及其基因水平變化 （n=3，±s）

Tab.2 Changes of TNF-α,IL-6 and MCP-1 proteins and their gene levels in each group表2各組細胞中TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白及其基因水平變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與ox-LDL組比較，c與低劑量PCSK9抑制劑組比較，d與中劑量PCSK9抑制劑組比較，P＜0.05；表3、4同

組別TNF-αIL-6MCP-1基因 蛋白（ng/L） 基因 蛋白（ng/L） 基因 蛋白（ng/L）Control組1.03±0.2256.65±2.111.06±0.3516.59±2.061.05±0.36149.67±4.39 ox-LDL組9.29±1.20a93.21±8.02a4.91±0.59a34.65±3.44a17.21±1.52a272.81±15.10a低劑量PCSK9抑制劑組8.26±1.00a88.87±8.65a3.15±0.42ab31.50±2.64a7.63±1.73ab238.99±10.93a中劑量PCSK9抑制劑組4.57±1.55abc72.24±6.80ab2.54±0.45ab28.39±2.14ab6.29±0.46ab226.66±7.95ab高劑量PCSK9抑制劑組3.88±1.77abc67.03±9.14abc2.16±1.10bc22.82±2.13ab2.80±0.60bcd207.26±4.77abc F 14.160＊＊119.419＊＊9.760＊＊111.619＊＊65.989＊＊142.917＊＊

Fig.2 Changes of apoptosis levels in each group圖2各組細胞凋亡水平變化

Tab.3 The changes of the expressions of apoptosis-related proteins and p-NF-κB in each group表3各組細胞凋亡相關(guān)蛋白及p-NF-κB表達變化 （n=3，±s）

Tab.3 The changes of the expressions of apoptosis-related proteins and p-NF-κB in each group表3各組細胞凋亡相關(guān)蛋白及p-NF-κB表達變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別BaxBcl-2Cleaved-Caspase-3PCSK9p-NF-κB/NF-κB Control組0.52±0.050.64±0.020.17±0.050.26±0.020.47±0.12 ox-LDL組0.85±0.08a0.30±0.05a0.64±0.09a0.59±0.03a1.14±0.08a低劑量PCSK9抑制劑組0.78±0.06a0.33±0.03a0.61±0.07a0.53±0.03a1.03±0.06b中劑量PCSK9抑制劑組0.71±0.07b0.44±0.03ab0.56±0.03ab0.43±0.02ab0.61±0.01abc高劑量PCSK9抑制劑組0.56±0.07bc0.67±0.08bcd0.36±0.04abcd0.27±0.01bcd0.57±0.03abc F 8.881＊＊24.127＊＊20.362＊＊73.227＊＊58.210＊＊

Fig.3 Results of Western blot detection of apoptosis-related protein expression level in HUVECs圖3 Western blot檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平

Tab.4 The changes of the expressions of NF-κB in nucleus and cytoplasm in each group表4各組細胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達變化（n=3，±s）

Tab.4 The changes of the expressions of NF-κB in nucleus and cytoplasm in each group表4各組細胞核及胞質(zhì)中NF-κB表達變化（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別 細胞核 細胞質(zhì)NF-κB/Histone H3NF-κB/GAPDH Control組0.44±0.031.07±0.06 ox-LDL組1.09±0.11a0.40±0.03a低劑量PCSK9抑制劑組0.91±0.02a0.76±0.02ab中劑量PCSK9抑制劑組0.79±0.10abc0.88±0.08b高劑量PCSK9抑制劑組0.74±0.05abc1.16±0.12bcd F 23.383＊＊34.107＊＊

Fig.4 The protein expression levels of NF-κB in cytoplasm and nucleus of each group detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測各組細胞質(zhì)及細胞核中NF-κB蛋白表達水平

3 討論

內(nèi)皮細胞損傷和功能異常是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要誘發(fā)因素。內(nèi)皮細胞損傷常伴隨炎癥反應(yīng)，炎性細胞大量浸潤直接影響中性粒細胞對內(nèi)皮細胞的黏附，誘發(fā)炎性因子募集，進而加劇內(nèi)皮損傷。

PCSK9不僅參與脂代謝，還與細胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。無內(nèi)毒素的重組PCSK9可使促炎性因子（如IL-1β、TNF-α、MCP-1和IL-6）在初級巨噬細胞和THP-1巨噬細胞中表達增加［10］。此外，PCSK9還可激活TLR4/NF-κB通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后PCSK9表達上調(diào)，激活自噬，增加心肌梗死面積，降低心功能，提示PCSK9過表達可能是動脈粥樣硬化發(fā)病機制之一［11］。在載脂蛋白E基因敲除（apoEKO）小鼠中發(fā)現(xiàn)，沉默PCSK9表達可通過減輕血管炎癥反應(yīng)和抑制TLR4/NF-κB信號通路直接抑制動脈粥樣硬化［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理的HUVECs中TNF-α、IL-6和MCP-1等炎性因子均明顯增加，表明ox-LDL可使內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)加劇，而經(jīng)10、20 μmol/L的PCSK9抑制劑干預(yù)后炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌水平明顯下降，提示PCSK9抑制劑可以減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。

隨著動脈粥樣硬化的進展，內(nèi)皮細胞凋亡能夠損傷內(nèi)皮的完整性并增加通透性，誘發(fā)血管損傷和斑塊形成。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL處理后的HUVECs細胞存活率明顯降低，細胞凋亡增加。PCSK9抑制劑干預(yù)后，明顯逆轉(zhuǎn)ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs細胞存活率降低，減少細胞凋亡。研究表明，下調(diào)PCSK9表達抑制HUVECs的凋亡主要通過Bcl/Bax-Caspase9-Caspase3線 粒 體 凋 亡 通 路［13］。PCSK9Qβ-003疫苗通過調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、抑制炎性細胞浸潤和凋亡來減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展［14］。本研究結(jié)果顯示PCSK9抑制劑可以明顯下調(diào)Cleaved-Caspase-3表達，上調(diào)Bcl-2表達。另有研究表明PCSK9通過損傷線粒體DNA加重Caspase-1依賴的細胞凋亡，促炎因子和凋亡可能是治療PCSK9相關(guān)心血管疾病的潛在靶點［15］。此外，筆者發(fā)現(xiàn)PCSK9抑制劑通過影響NF-κB入核發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，抑制細胞凋亡，但其具體深入的核內(nèi)調(diào)控機制目前還在探索中。

綜上所述，本研究初步證實PCSK9抑制劑可抑制ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，增加細胞活性；但這些效果是否獨立于降脂作用尚不完全清楚。PCSK9抑制劑作為新型降脂藥在抗動脈粥樣硬化中的作用及其機制尚需更多的基礎(chǔ)及臨床研究來揭示，進而為臨床防治心血管疾病提供更加充分的理論依據(jù)。