林杰，王衛(wèi)東，區(qū)活輝，何威，陳堅平，馬靖，左海波，劉清波

肝膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）來源于肝臟二級膽管樹，發(fā)病率居肝臟原發(fā)性惡性腫瘤第2位，僅次于肝細胞癌［1］，其危險因素主要包括肝臟吸蟲慢性感染、原發(fā)性硬化性膽管炎以及肝炎病毒感染等［2-4］。ICC具有發(fā)病隱匿、進展迅速、根治性切除率低等特點，臨床預后較差［5］。雖然根治性切除率不斷提高，但是ICC容易沿著膽管壁、神經和淋巴管向遠處轉移［6-7］，術后復發(fā)率高達80.0%，5年生存率僅為5.0%～15.0%［8-9］。與肝細胞癌不同，ICC目前尚無療效確切的靶向治療藥物［10］。因此，深入研究ICC的發(fā)病機制，挖掘特異性表達基因，嘗試發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點，改善ICC患者的整體預后是目前研究的方向。C型凝集素結構域家族5成員A（C-type lectin domain family 5，member A，CLEC5A）為Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達于髓系細胞細胞膜，與血液系統(tǒng)細胞的惡性分化密切相關［11］，其低表達于急性髓系白血病，可能發(fā)揮抑癌作用［12］。然而，該基因與ICC的關系國內外尚少見報道。本文擬通過免疫組化染色檢測ICC患者癌組織和癌旁組織中CLEC5A的表達，利用慢病毒轉染技術構建CLEC5A過表達RBE細胞株，分析CLEC5A對細胞生物學特性的影響，從而揭示CLEC5A在ICC發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源ICC癌組織和癌旁組織均為石蠟組織標本，源自2014年1月—2015年10月在我院行根治性手術治療的25例ICC患者。所有患者術后均經病理學檢查確診，術前未經放化療等抗腫瘤治療，患者均已簽署知情同意書，研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核（文件批準號2020091）。

1.2 主要試劑及儀器ICC RBE細胞株購自中科院上海細胞庫，慢病毒購自上海吉凱公司。Trizol試劑購自上海普飛公司，實時熒光定量PCR（qPCR）及逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司，基因引物購自上海吉凱公司，CLEC5A兔抗人多克隆抗體（ab203200）購自美國Abcam公司，PV-9001二步法免疫組化檢測系統(tǒng)購自北京中杉金橋公司，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基及Matrigel基質膠購自美國Corning公司，CCK-8（cell counting kit-8）試劑購自日本同仁公司，細胞周期檢測試劑盒購自美國Sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；熒光定量PCR儀（LightCycler480 II）購自瑞士Roche公司，正置顯微鏡（CX23）購自日本OLYMPUS公司，酶標儀（M2009PR）購自瑞士Tecan公司，流式細胞儀（C6 PLUS）購自美國BD公司。

1.3 免疫組化染色法檢測CLEC5A表達水平 癌組織及配對癌旁組織石蠟標本制作成4 μm切片，經常規(guī)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化等預處理，高溫抗原修復15 min，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，4℃過夜孵育一抗（1∶100），次日經磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌，孵育二抗30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）鏡下控制顯色，蘇木素復染細胞核，自來水返藍后常規(guī)中性樹脂封片。免疫組化染色結果判斷標準［13］：按染色強度將無染色、輕度染色、中度染色及深度染色記為0分、1分、2分和3分；按染色細胞比例，將＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%及≥76%記為0分、1分、2分、3分及4分；兩者的乘積代表CLEC5A蛋白表達水平，總分為0～12分。

1.4 慢病毒轉染技術構建CLEC5A過表達RBE細胞株ICC細胞RBE使用含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基，置于含5%CO2、37℃飽和濕度環(huán)境中進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的RBE細胞接種于6孔板，當融合度達15%～30%后，按感染復數(shù)（MOI）=10加入慢病毒溶液，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，感染后72 h收集細胞進行后續(xù)檢測。實驗設置轉染過表達組和對照組。

1.5 qPCR驗證CLEC5A過表達細胞模型 以Trizol試劑提取細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒將細胞總RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板按照SYBR Green I法使用相應試劑盒進行目的基因的qPCR反應。CLEC5A引物上游5'-CCCAACGGCTTCATTACCAC-3'，下游5'-TGTTGATCCAACGCCACCTT-3'；GAPDH引物上游5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。

1.6 CCK-8法檢測細胞活力RBE細胞按1×103個/孔接種于96孔板，分別在0、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8試劑，避光環(huán)境下孵育2 h，然后在紫外分光光度儀選擇450 nm波長測定吸光度，繪制細胞生長曲線。

1.7 流式法檢測細胞周期和細胞凋亡 收集5×105個RBE細胞，PBS輕柔洗滌細胞后，分別按照細胞凋亡檢測試劑和細胞周期檢測試劑說明書對細胞進行染色標記處理，流式細胞儀進行上機檢測，使用NovoExpress軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪圖。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力 以無血清培養(yǎng)基重懸RBE細胞，按照5×104/孔接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的基礎培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定細胞15 min，結晶紫染色10 min，取出小室，用棉簽輕柔拭去小室內側膜細胞，顯微鏡下隨機讀取5個觀察視野進行細胞計數(shù)并拍照。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，2組數(shù)據(jù)比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CLEC5A在ICC患者組織中的表達情況 免疫組化染色顯示，CLEC5A蛋白主要表達在膽管上皮細胞或肝細胞細胞質內，根據(jù)染色評分標準，癌組織染色評分（3.64±0.51）明顯低于癌旁組織（5.72±0.72，n=25，t=2.353，P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Expression of CLEC5A protein in ICC tissues and adjacent normal tissues(immunohistochemical staining,×200)圖1 CLEC5A蛋白在ICC組織和癌旁組織中的表達情況（免疫組化，×200）

2.2CLEC5A過表達RBE細胞模型的鑒定qPCR結果顯示，過表達組CLEC5A表達水平（168.02±24.39）較對照組（1.00±0.02）明顯上調（t=6.848，P＜0.01）。

2.3 過表達CLEC5A對RBE細胞增殖能力的影響CCK-8增殖實驗結果顯示，接種24 h后，過表達組細胞的生長曲線較對照組增長減緩（t48h=7.569，t72h=10.080，t96h=15.540，均P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Growth curves of RBE cells in the two groups圖2 2組RBE細胞的生長曲線

2.4 過表達CLEC5A對RBE細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測顯示，過表達組RBE細胞凋亡比例（19.20%±0.51%）高 于 對 照 組（7.72%±0.19%，t=21.060，P＜0.01），見圖3。

Fig.3 Apoptotic rate of RBE cells in the two groups圖3 2組RBE細胞的凋亡比例

2.5 過表達CLEC5A對RBE細胞周期的影響 流式細胞儀檢測顯示，過表達組細胞各期比例（%）分別 為：G1期69.48±0.43，S期14.39±0.23，G2/M期13.30±0.37；對照組細胞各期比例分別為：G1期70.79±0.57，S期15.22±0.91，G2/M期11.64±0.86。過表達組細胞處于G1期的比例低于對照組（t=3.185，P＜0.05），2組細胞處于S期的細胞比例差異無統(tǒng)計學意義，而過表達組細胞處于G2/M期的比例高于對照組（t=3.092，P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Cell cycle distribution of RBE cells in the two groups圖4 2組RBE細胞的周期分布情況

2.6過表達CLEC5A對RBE細胞遷移及侵襲能力的影響Transwell實驗顯示，過表達組遷移細胞數(shù)（60.34±4.33）較對照組（105.67±6.98）明顯減少（t=5.516，P＜0.01），過表達組侵襲細胞數(shù)（32.33±1.76）較對照組（68.33±1.76）明顯減少（t=14.430，P＜0.05），見圖5。

3 討論

ICC的高復發(fā)率使其成為一種難治性肝臟惡性腫瘤，其轉移復發(fā)過程涉及一系列基因、蛋白以及相關分子信號通路的調控［14-15］。已有研究表明，CNRIP1、DCLK1、SNHG20等基因均參與ICC的發(fā)生發(fā)展，然而其機制仍不明確，目前尚未發(fā)現(xiàn)對ICC有明確作用的治療靶點，仍需進一步研究［16-18］。CLEC5A是一個與血液細胞惡變存在密切關系的腫瘤相關基因，CLEC5A的表達在骨肉瘤肺轉移進程中明顯下調，過表達該基因可顯著抑制骨肉瘤細胞株SJSA-1的遷移和侵襲能力；進一步的機制研究顯示，CLEC5A介導c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路調控骨肉瘤的肺轉移進程，并與骨肉瘤患者的預后具有顯著相關性［19］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，CLEC5A在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用，其通過介導磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路調控腫瘤細胞的增殖、遷移特性，并促進腫瘤的肺轉移過程［20］。本研究發(fā)現(xiàn)CLEC5A在ICC組織中呈現(xiàn)顯著的低表達水平；進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達CLEC5A能夠抑制ICC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示CLEC5A可能是一個ICC抑癌基因。

過度增殖是ICC的基本特征之一，而抑制腫瘤細胞過度增殖是抗ICC治療的途徑之一［21］。CCK-8增殖曲線能夠反映觀察時間內細胞增殖速度的差異。本研究顯示，CLEC5A過表達后ICC細胞增殖能力明顯降低，說明CLEC5A可能通過抑制ICC的增殖特性而發(fā)揮抑癌作用。

正常組織中細胞增殖、分化和凋亡維持著正常的動態(tài)平衡，而腫瘤組織不僅存在增殖和分化異常，同時也存在凋亡異常［22］。腫瘤細胞為了實現(xiàn)無限增殖，往往會抑制細胞凋亡發(fā)生，而細胞凋亡受阻將打破正常組織中細胞增殖與凋亡的平衡，致使細胞凋亡率下降［23］。本研究通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，CLEC5A過表達組細胞的凋亡率較對照組細胞明顯增加，表明CLEC5A對ICC增殖能力的調控與細胞凋亡密切相關。細胞周期紊亂也是影響細胞增殖和分化的重要原因之一［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，CLEC5A過表達后ICC細胞G1期比例減少，S期細胞比例不變，G2/M期比例增加，說明CLEC5A可能通過阻滯G2/M期細胞周期轉換而抑制ICC的增殖能力和分化能力。惡性腫瘤的復發(fā)轉移與患者的較差預后有直接相關性，其主要取決于腫瘤細胞的遷移、侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)CLEC5A過表達后ICC細胞遷移及侵襲數(shù)量均明顯減少，提示CLEC5A能夠抑制ICC的轉移能力。既往研究也表明，CLEC5A高表達與骨肉瘤發(fā)生肺轉移密切相關［20］。因此，筆者推測CLEC5A可能是通過調節(jié)ICC細胞凋亡、細胞周期各期比例、遷移及侵襲能力影響ICC的分化、增殖以及轉移，具體作用機制仍有待進一步實驗探究。

綜上所述，本研究明確了CLEC5A對ICC的抑制作用，它可以抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，并調控腫瘤細胞周期轉換，誘導細胞凋亡，具有抗增殖和抗轉移作用，是ICC精準治療的潛在靶點。