陳嬌，張妍，鐘媛媛

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見于育齡期女性的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病。其基本特征為卵巢多囊樣病理改變、高雄激素血癥及排卵生理功能障礙，多數(shù)患者同時還伴有胰島素抵抗、糖尿病、肥胖、高脂血癥等代謝異常綜合征［1-2］。目前關(guān)于PCOS的發(fā)病機制仍不清晰，但卵巢顆粒細胞異常增殖與PCOS之間存在密切聯(lián)系［3］。微小RNA（microRNA，miR）是一類具有高度保守特點的單鏈非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄后水平對細胞增殖、凋亡、生長、分化等多種生物學(xué)功能產(chǎn)生影響［4-5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-141可有效調(diào)控卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為［6-7］，但其通過何種信號通路發(fā)揮上述作用尚未明確。此外還有研究證實，miR-141在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）信號通路調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［8-9］；而PI3K信號通路與PCOS胰島素抵抗有著密切聯(lián)系，由此推測miR-141可能通過PI3K信號通路影響PCOS的發(fā)展過程。本研究擬探討miR-141通過PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mamalian target of rapamycin，mTOR）信號通路促進PCOS卵巢顆粒細胞增殖的作用機制，為后續(xù)PCOS治療提供新的靶點和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2018年2月—2019年12月在武漢市婦幼保健院婦產(chǎn)科確診為PCOS的20例患者的卵巢組織，患者平均年齡（29.5±7.1）歲。同期從20例因卵巢良性疾病行手術(shù)的患者中獲取正常卵巢組織作為對照組，患者平均年齡（30.3±7.6）歲。2組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.371，P＞0.05）。人卵巢顆粒細胞KGN、人正常卵巢上皮細胞IOSE80均購自武漢大學(xué)生物典型培養(yǎng)物保藏中心；miR-141 minics及無義序列miR-141 Negative Control均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量及ECL發(fā)光檢測試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR premix Ex Taq試劑盒均購自日本TaKaRa公司；mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）、PI3K抑制劑LY294002均購自北京百奧萊博科技有限公司；PI3K、p-Akt、p-mTOR鼠抗人單克隆抗體及GAPDH抗體均購自美國Bioworld生物公司；羊抗鼠二抗購自武漢博士德生物公司；miR-141及U6引物由上海生工生物工程合成；熒光定量PCR儀購自韓國BIONEER公司；電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有參與者均知情并簽署同意書。

1.2 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測miR-141mRNA表達水平 采用TRIzol試劑盒分別提取卵巢組織、KGN及IOSE80細胞總RNA，并檢測RNA濃度和純度，確定符合后續(xù)實驗要求后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR反應(yīng)總體積20 μL，包括1.5 μL cDNA模板，1 μL miR-141或U6引物，10 μL miRNA SYBR premix Ex Taq，7.5 μL H2O。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃20 s，60℃20 s，72℃40 s，循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參 ，采用2-ΔΔCt法分析卵巢組織及細胞miR-141mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 將KGN細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞融合至90%時采用胰蛋白酶溶液消化傳代處理，傳至第3代時取對數(shù)生長期細胞進行實驗。以2×105/孔的細胞密度接種至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，分為miR-141 minics組（轉(zhuǎn)染miR-141 minics）、LY294002+miR-141 minics組（轉(zhuǎn)染miR-141 minics前1 h采用50 mmol/L LY294002處理）、rapamycin+miR-141 minics組（轉(zhuǎn)染miR-141 minics前1 h采用50 μmol/L rapamycin處理）、NC組（轉(zhuǎn)染miR-141 Negative Control）、對照組（不做任何處理）。

1.4 MTT法檢測各組細胞增殖情況 取對數(shù)生長期細胞消化成單細胞懸液，計數(shù)后制成1.5×105/mL懸液，細胞分組轉(zhuǎn)染后以每孔100 μL加入到96孔板中，37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每組設(shè)6個平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對照，分別處理24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150 μL的DMSO溶解MTT，于490 nm處檢測光密度（OD）值，以O(shè)D值為縱軸，培養(yǎng)時間為橫軸，繪制細胞增殖曲線。

1.5 平板克隆實驗進行細胞克隆形成能力檢測 各組細胞轉(zhuǎn)染后以200個/皿接種細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中孵育14 d，待肉眼可見培養(yǎng)皿內(nèi)有細胞克隆形成出現(xiàn)。PBS溶液洗滌干凈后采用多聚甲醛溶液固定處理15 min，然后采用結(jié)晶紫溶液染色處理20 min，待風(fēng)干后在熒光顯微鏡下隨機讀取5個視野計算細胞克隆數(shù)。細胞克隆形成率=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.6 Western blot檢測各組PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后提取細胞總蛋白，并定量檢測蛋白含量，蛋白變性處理后電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，隨后置于牛血清白蛋白中封閉4 h，取出PVDF膜后分別置于含PI3K、p-Akt、p-mTOR鼠抗人一抗及內(nèi)參一抗（1∶500）的平皿中孵育過夜，然后將膜置于含羊抗鼠二抗（1∶500）的平皿中，繼續(xù)室溫環(huán)境下孵育處理2 h。最后TBS洗滌后顯色、拍照和分析各條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，以相對灰度值表示PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織和細胞miR-141mRNA表達水平比較PCOS卵巢組織miR-141mRNA表達水平顯著高于正常卵巢組織（2.47±0.41vs.1.12±0.30，n=20，t=11.884，P＜0.05），人卵巢顆粒細胞KGNmiR-141mRNA表達水平高于人正常卵巢上皮細胞IOSE80（3.19±0.54vs.1.24±0.35，n=3，t=5.249，P＜0.05）。

2.2 各組細胞轉(zhuǎn)染后miR-141mRNA表達水平比較miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組、rapamycin+miR-141 minics組、NC組及對照組miR-141mRNA表達水平分別為5.72±0.69、5.60±0.66、5.76±0.71、1.02±0.11和1.00±0.00，miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組及rapamycin+miR-141 minics組miR-141mRNA表 達水平均高于NC組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=14.326，P＜0.05）。

2.3 各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖和克隆形成能力比較LY294002+miR-141 minics組 及rapamycin+miR-141 minics組轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h OD值和克隆形成率均低于miR-141 minics組，但高于NC組和對照組（P＜0.05）。NC組、對照組轉(zhuǎn)染后不同時間點OD值及克隆形成率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、圖1。

2.4 各組細胞轉(zhuǎn)染后PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組 及rapamycin+miR-141 minics組PI3K蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但均高于NC組和對照組（P＜0.05）。LY294002+miR-141 minics組轉(zhuǎn)染后p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平低于miR-141 minics組，但高于NC組、對照組（P＜0.05）。rapamycin+miR-141 minics組 轉(zhuǎn) 染后p-mTOR蛋白表達水平低于miR-141 minics組，高于NC組、對照組（P＜0.05），見表3、圖2。

3 討論

PCOS發(fā)病原因及機制極為復(fù)雜，具有較高的臨床異質(zhì)性，近些年關(guān)于卵巢顆粒細胞在PCOS發(fā)生、發(fā)展過程中的相關(guān)研究越來越多［10-11］。卵巢顆粒細胞可與卵母細胞發(fā)生縫隙連接，進而在卵母細胞的成長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，卵巢顆粒細胞明顯增殖可導(dǎo)致PCOS的發(fā)生發(fā)展。miRNA廣泛存在于機體各種臟器組織及細胞中，參與較多生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)［12］。研究認為，miRNA在多個方面對PCOS發(fā)生產(chǎn)生影響，如影響卵泡生長發(fā)育或生理學(xué)功能、卵巢各種激素的調(diào)控作用、顆粒細胞增殖和凋亡等［13］。

Tab.2 Comparison of proliferation and cloning ability after transfection between the five groups表2各組轉(zhuǎn)染后增殖和克隆形成能力比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of proliferation and cloning ability after transfection between the five groups表2各組轉(zhuǎn)染后增殖和克隆形成能力比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與NC組比較，c與miR-141minics組比較，P＜0.05

組別OD值 克隆形成率（%）24 h48 h72 h96 h對照組0.33±0.030.41±0.030.54±0.040.66±0.0344.72±1.81 NC組0.34±0.030.40±0.020.55±0.030.65±0.0344.51±1.93 miR-141 minics組0.53±0.04ab0.67±0.05ab0.77±0.04ab0.91±0.04ab62.93±2.12ab LY294002+miR-141 minics組0.45±0.03abc0.51±0.04abc0.65±0.03abc0.78±0.04abc51.04±1.79abc rapamycin+miR-141 minics組0.42±0.03abc0.50±0.03abc0.64±0.04abc0.77±0.03abc50.81±1.58abc F 19.703＊28.021＊19.662＊28.551＊48.794＊

Fig.1 Diagram of clone formation after transfection in each group圖1各組轉(zhuǎn)染后克隆形成圖

Tab.3 Comparison of related protein expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway after transfection between the five groups表3各組轉(zhuǎn)染后PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of related protein expression levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway after transfection between the five groups表3各組轉(zhuǎn)染后PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與NC組比較，c與miR-141minics組比較，d與LY294002+miR-141 minics組比較，P＜0.05

組別PI3Kp-Aktp-mTOR對照組0.22±0.060.32±0.080.32±0.09 NC組0.23±0.070.30±0.070.31±0.08 miR-141 minics組1.25±0.16ab1.16±0.16ab1.28±0.17ab LY294002+miR-1411.24±0.16ab0.75±0.11abc0.81±0.13abc minics組rapamycin+miR-1411.28±0.18ab1.18±0.17abd0.78±0.11abc minics組F 9.145＊35.626＊33.740＊

Fig.2 The related protein expressions of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway after transfection in each group圖2各組轉(zhuǎn)染后PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達

miR-141屬于miR-200家族成員，位于人類染色體12p13.31，是一個全長為22個核苷酸的成熟序列［14］。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-141可作為癌基因或抑癌基因，通過調(diào)控相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種惡性腫瘤中呈異常表達，從而參與惡性腫瘤細胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)行為改變［15-17］。但是其在PCOS卵巢組織及卵巢顆粒細胞中表達的相關(guān)文獻報道相對較少。本研究采用qPCR法檢測顯示，PCOS卵巢組織及人卵巢顆粒細胞KGN中miR-141mRNA表達水平均分別高于正常卵巢組織和人正常卵巢上皮細胞IOSE80，提示PCOS卵巢組織及卵巢顆粒細胞miR-141呈高表達狀態(tài)，與既往研究相符［18］。本研究將KGN細胞進行分組研究，結(jié)果顯示miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組及rapamycin+miR-141 minics組miR-141mRNA表達水平比較無明顯差異，且均高于NC組、對照組，提示miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組及rapamycin+miR-141 minics組 細 胞 轉(zhuǎn) 染miR-141 minics后miR-141mRNA表達水平均明顯升高，且3組之間未因有PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)抑制劑作用而出現(xiàn)差異性表達。通過MTT法及平板細胞克隆法檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖和克隆形成能力，結(jié)果顯示LY294002+miR-141 minics組及rapamycin+miR-141 minics組轉(zhuǎn)染后不同時間點OD值及克隆形成率均明顯低于miR-141 minics組，但高于NC組、對照組，提示miR-141mRNA表達水平升高可明顯促進細胞的增殖和克隆形成能力，而采用PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)抑制劑作用后細胞增殖和克隆形成能力均受到明顯抑制，miR-141可能通過PI3K/Akt/mTOR信號通路對人卵巢顆粒細胞KGN增殖過程產(chǎn)生影響。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是一個參與調(diào)控機體內(nèi)細胞增殖、凋亡最主要的信號傳導(dǎo)通路，可參與調(diào)節(jié)卵母細胞生長，原始卵泡發(fā)育及顆粒細胞增殖、分化等生物學(xué)行為。PI3K被激活后可催化位于細胞膜內(nèi)表面上的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），進而生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），后者可激活A(yù)kt，進而調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的生物學(xué)活性功能，最終發(fā)揮促進或抑制細胞凋亡的作用［19］。mTOR則是PI3K-Akt軸下游的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可有效促進或抑制細胞增殖，在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育過程中起著重要的作用［20］。本研究結(jié)果顯示，miR-141 minics組、LY294002+miR-141 minics組及rapamycin+miR-141 minics組PI3K蛋白表達水平比較無明顯差異，而LY294002+miR-141 minics組轉(zhuǎn)染后p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯低于miR-141 minics組，rapamycin+miR-141 minics組轉(zhuǎn)染后p-mTOR蛋白表達水平明顯低于miR-141 minics組，提示LY294002作用后可有效抑制p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平，而rapamycin作用后可有效抑制p-mTOR蛋白表達水平，提示miR-141可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進卵巢顆粒細胞的增殖。

綜上所述，miR-141高水平表達可促進卵巢顆粒細胞的增殖，其作用機制與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。miR-141在PCOS卵巢組織中和卵巢顆粒細胞中表達量升高，可能與miR-141促進卵巢顆粒細胞增殖有關(guān)，本研究為后續(xù)的PCOS治療提供了新的靶點和思路。