何薈如 林杰 吳葉蝶 潘泓靜 彭志松 蘇祝成

摘要：【目的】克隆茶樹細(xì)胞色素P450（CYP）酶系的CYP79酶基因CsCYP79A1，并進(jìn)行表達(dá)分析，為探究Cs-CYP79A1基因參與茶樹防御的響應(yīng)機制及在烏龍茶制作過程中的調(diào)控功能提供理論依據(jù)。【方法】克隆CsCYP79A1基因，通過生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行分析，用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在不同茶樹品種、不同嫩度葉片以及不同搖青次數(shù)葉片中的表達(dá)特性，并采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定不同處理葉片中的苯乙腈釋放量，以分析其與CsCYP79A1基因表達(dá)量的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】克隆獲得的茶樹CsCYP79A1基因編碼區(qū)（CDS）序列長度為1617 bp，編碼538個氨基酸殘基，相對分子量為61.07 kD，理論等電點（pI）7.64，為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白。CsCYP79A1蛋白與中華獼猴桃TXG46886.1的氨基酸序列相似性最高，達(dá)87%。CsCYP79A1蛋白存在2個跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，共有40個磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占氨基酸序列的49.07%、4.28%、11.71%和34.94%，三級結(jié)構(gòu)與鐵銹醇合酶的晶體結(jié)構(gòu)（5ylw.1.A）相似度為26.61%。在4次搖青處理后，金萱和黃觀音第3葉片中的CsCYP79A1基因表達(dá)量高于浙農(nóng)113、白葉1號和福鼎大白茶，說明CsCYP79A1基因在適制烏龍茶的茶樹品種中的表達(dá)量較高;CsCYP79A1基因在第3葉中的表達(dá)量顯著高于第1葉和頂芽（P<0.05），且隨著搖青次數(shù)的增加呈先升高后降低的變化趨勢。4次搖青處理后，第3葉會釋放大量苯乙腈，而第1葉和頂芽釋放少量或不釋放苯乙腈。苯乙腈的釋放量隨搖青處理次數(shù)的增加呈逐漸升高趨勢?！窘Y(jié)論】CsCYP79A1基因表達(dá)量與茶樹品種、葉片嫩度和搖青次數(shù)密切相關(guān)，且其表達(dá)量和苯乙腈釋放量均為第3葉最高，故推測CsCYP79A1基因是苯乙腈合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因。

關(guān)鍵詞： 茶樹;CsCYP79A1;基因克隆;苯乙腈;生物信息學(xué);表達(dá)分析

中圖分類號： S571.103.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0641-10

Cloning and expression analysis of CsCYP79A1 gene in tea plant

HE Hui-ru， LIN Jie， WU Ye-die， PAN Hong-jing， PENG Zhi-song， SU Zhu-cheng*

（College of Agriculture and Food Science， Zhejiang Agriculture and Forestry University，

Linan， Zhejiang? 311300， China）

Abstract：【Objective】The CYP79 enzyme gene CsCYP79A1 of tea plant cytochrome P450（CYP） enzyme system was cloned，and its bioinformatics analysis and expression analysis were performed to provide a theoretical basis for in-depth understanding of the mechanism of CsCYP79A1 gene involved in the defense response of tea plant and its function in the production process of oolong tea. 【Method】The CsCYP79A1 gene was cloned using Huangguanyin leaves as materials，and the gene was analyzed by analysis softwares. Real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） was used to detect its expression in different tea varieties ，different tenderness leaves and different shaking times to analyze its expression characteristics. Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） was used to determine the volatilization of phenylacetonitrile in leaves of different treatments to analyze its relationship with the expression of CsCYP79A1 gene. 【Result】The cloned tea plant CsCYP79A1 gene coding region（CDS） was 1617 bp in length，encoded 538 amino acids，had a relative molecular mass of 61.07 kD and a theoretical isoelectric point（pI） of 7.64，and it was an unstable liposoluble hydrophilic protein. The amino acid sequence of CsCYP79A1 protein had the highest similarity with TXG46886.1 （Actinidia chinensis），reaching 87%. The CsCYP79A1 protein had two transmembrane structures，no signal peptide，and had 40 phosphorylation sites. In the secondary structure，α-helix，β turn，extended chain and random coil accounted for 49.07%，4.28%，11.71%，and 34.94% of the amino acid sequence，respectively. The similarity between the tertiary structure and the crystal structure of rust alcohol synthase（5ylw.1.A） was 26.61%. After four times shaking treatments，the expression of CsCYP79A1 gene in the third leaves of Jinxuan and Huangguanyin was significantly higher than that of Zhenong 113，Baiye No. 1 and Fuding Dabaicha，indicating that the expression level of CsCYP79A1 gene was higher in varieties which were suitable for making oolong tea. The expression level in the third leaves was significantly higher than that in the first leaves and terminal bud（P<0.05） and with the increase of the number of shaking，the expression level first increased and then decreased. After 4 shaking treatments，the third leaf released a large amount of phenylacetonitrile，while the first leaf and apical buds released a little or no phenylacetonitrile. In leaves with different shaking times，the volatilization of phenylacetonitrile increased with the increase of shaking times. 【Conclusion】The expression level of CsCYP79A1 gene is related to tea variety，leaf tenderness and the degree of shaking，and both the expression level and the release of phenylacetonitrile are the highest in the third leaf. Therefore，it is speculated that CsCYP79A1 gene is one of the key genes in the synthesis of phenylacetonitrile.

Key words： tea plant; CsCYP79A1; gene cloning; phenylacetonitrile; bioinformatics; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31800582）;Zhejiang Agriculture and Forestry University Student Research Training Project（113-2013200155）

0 引言

【研究意義】茶樹[Camellia sinensis（L.） O. Kuntze.]為多年生常綠木本植物，屬山茶科山茶屬灌木或小喬木，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物（劉玉飛等，2020）。苯乙腈（Phenylacetonitrile，PAN）是一種創(chuàng)傷誘導(dǎo)揮發(fā)物，在茶樹受害蟲侵害及烏龍茶做青時均會導(dǎo)致苯乙腈生成（蔡曉明，2009;唐顥等，2015;周春娟等，2015）。有研究證實，細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）酶系中的CYP79家族酶類可催化L-苯丙氨酸合成（E/Z）-苯乙醛肟（PAOx，phenylacetaldoxi-me），而（E/Z）-PAOx是苯乙腈的直接前體，苯乙腈的合成量受CYP79基因表達(dá)水平調(diào)控（Irmisch et al.，2013;Yamaguchi et al.，2016）。因此，挖掘并研究與苯乙腈合成相關(guān)基因?qū)Σ铇湓耘嗉盀觚埐柚谱骶哂兄匾饬x。【前人研究進(jìn)展】CYP是一類存在于微生物、植物和動物中的膜蛋白超家族酶系（宋展等，2020）。目前，已從不同生物體中分離出超過50000種CYP酶，而植物中的CYP酶主要參與保護(hù)性毒素、驅(qū)避劑分子和各種信號分子的生物合成（宋廷宇等，2010;宋展等，2020）。Irmisch等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在酵母中異源表達(dá)的楊樹CYP79D6和CYP79D7基因均能產(chǎn)生不同醛肟的混合物。宋傲男等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜BnCYP79B1基因在高稈品系中的表達(dá)量較矮稈品系高，在高硫苷品系中較低硫苷品系高。王紅波等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)擬南芥CYP79F1基因的西蘭花植株過表達(dá)可顯著增加短鏈脂肪族芥子油苷的含量。Luck等（2017）在酵母中克隆重組了紅豆杉CYP79A118基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能將L-酪氨酸、L-色氨酸和L-苯丙氨酸分別轉(zhuǎn)化為對羥基苯乙醛肟、吲哚-3-乙醛肟和苯乙醛肟，而L-酪氨酸是首選底物。李占省等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，青花菜CYP79F1基因在根和莖中的表達(dá)量較高，葉中表達(dá)量最低。胡向陽等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，菘藍(lán)IiCYP79B2基因的表達(dá)受茉莉酸甲酯和葡萄糖信號的誘導(dǎo)，受水楊酸和低溫脅迫的抑制?！颈狙芯壳腥朦c】目前，鮮見有關(guān)茶樹CsCYP79A1基因克隆并分析茶樹品種、烏龍茶搖青次數(shù)和葉片嫩度等對其表達(dá)量影響的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆CsCYP79A1基因，通過生物信息學(xué)軟件對其進(jìn)行分析，用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在不同茶樹品種、不同嫩度葉片以及不同搖青次數(shù)葉片中的表達(dá)特性，并采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定不同處理葉片中的苯乙腈釋放量，以分析其與CsCYP79A1基因表達(dá)量的相關(guān)性，為深入了解CsCYP79A1基因參與茶樹的防御反應(yīng)機制及烏龍茶制作的變化規(guī)律提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試茶樹材料為浙江農(nóng)林大學(xué)茗茶園種植的黃觀音新梢的頂芽、第1葉和第3葉（圖1），以及白葉1號、福鼎大白茶、金萱和浙農(nóng)113等4個茶樹品種新梢的第3葉。黃觀音和金萱為適制烏龍茶的茶樹品種）。主要試劑：TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（柱式法）試劑盒、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒、TB Green? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）及凝膠電泳有關(guān)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;高保真PCR酶KOD-Plus-Neo購自東洋紡（上海）生物科技有限公司;PCR引物合成和DNA測序由北京擎科生物科技有限公司完成;正己烷和癸酸乙酯試劑購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;苯乙腈試劑購自上海麥克林生化科技有限公司。主要儀器設(shè)備：Biometra TOne基因擴增儀（耶拿，德國）、NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo，美國）、StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（Thermo，美國）和GCMS-QP2010PLUS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津，日本）。

1. 2 樣品處理

將上述采集的供試材料攤放18 h后進(jìn)行模擬搖青處理（即創(chuàng)傷處理），其中黃觀音的頂芽和第1葉及白葉1號、福鼎大白茶、金萱和浙農(nóng)113的第3葉均進(jìn)行4次模擬搖青處理;黃觀音的第3葉分別進(jìn)行0、2、4、6和8次搖青處理（1次搖青處理是指用竹籠以30 r/min的速度對葉片進(jìn)行7 min搖青），控制總攤青時間一致。處理結(jié)束后取部分樣品于4 ℃冰箱保存，用于苯乙腈含量檢測，剩下樣品于-80 ℃冰箱保存，用于基因克隆及基因表達(dá)量檢測，每份材料重復(fù)3次。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（柱式法）提取樣品總RNA，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用核酸檢測儀檢測其濃度和質(zhì)量。待RNA質(zhì)量檢測合格后，按PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 4 基因克隆

使用茶樹基因組學(xué)與生物信息學(xué)平臺（TPIA）（http：//tpia.teaplant.org）上的在線序列比對軟件，通過與其他植物中與苯乙腈合成途徑有關(guān)的催化酶CYP79基因（CYP79D7、CYP79D6和CYP79A61）（Irmisch et al.，2013，2015）進(jìn)行序列比對，并篩選獲得CsCYP79A1基因。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）設(shè)計一對特異性擴增CsCYP79A1基因編碼區(qū)（CDS）序列的引物（表1）。使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo對CsCYP79A1基因進(jìn)行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 48 s，進(jìn)行35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1. 5 生物信息學(xué)分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTp查找茶樹Cs-CYP79A1蛋白的同源氨基酸序列，并使用DNAMAN 6.0進(jìn)行多重比對。使用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）對Cs-CYP79A1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測;使用ProtScale（選擇Kyte & Doolittle法）（https：//web.expasy.org/protscale）進(jìn)行疏水性預(yù)測;使用TMHMM進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測;使用SignalP進(jìn)行信號肽預(yù)測;使用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測;使用SOPMA進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;使用Swiss-Model構(gòu)建蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

1. 6 qRT-PCR檢測

使用NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST在線軟件設(shè)計茶樹CsCYP79A1基因的qRT-PCR引物（表1），以CsGAPDH為內(nèi)參基因，按TB Green? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行qRT-PCR，每樣品設(shè)3次重復(fù)。

1. 7 苯乙腈釋放量的測定

使用頂空固相微萃取法（HP-SPME）進(jìn)行香氣萃?。簩⒏魈幚聿枞~放入250 mL錐形瓶中，加入5 μL 0.01‰（v/v）的癸酸乙酯（內(nèi)標(biāo)），用錫紙和封口膜密封，置于加熱器上60 ℃預(yù)熱10 min，再插入萃取針，萃取20 min。采用GC-MS法測定苯乙腈釋放量。GC條件：采用5 ms毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度維持在220 ℃;升溫程序為：初始柱溫為50 ℃，保持5 min，以2 ℃/min升至120 ℃，以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min，載氣（He，純度>99.999%）流速1.0 mL/min。MS條件：離子源EI，離子源溫度200 ℃，電力電壓70 eV，掃描質(zhì)子質(zhì)量范圍（m/z）35～500 amu。苯乙腈峰采用質(zhì)譜庫結(jié)合標(biāo)樣來鑒定，峰面積采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)。

1. 8 統(tǒng)計分析

使用Excel 2019和SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析。用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量，用Tukeys HSD法進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）。相對表達(dá)量柱形圖和苯乙腈釋放量柱形圖使用Origin 2017繪制。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CsCYP79A1基因克隆結(jié)果

在TPIA搜索獲得茶樹品種舒茶早的CsCYP79A1基因全長3174 bp，CDS序列為1620 bp，編碼539個氨基酸殘基。本研究克隆獲得的黃觀音CsCYP79A1基因CDS長為1617 bp，編碼538個氨基酸殘基（圖2），與舒茶早的CsCYP79A1基因相比，有26個位點的氨基酸存在差異。

2. 2 CsCYP79A1蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過BLASTp同源比對搜索，獲得7條與Cs-CYP79A1蛋白同源性較高的序列，分別是中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）TXG46886.1、原葉杜鵑（Rhododendron williamsianum）CDP18411.1、紅雞蛋花（Plumeria rubra）KAA3489482.1、藍(lán)果樹（Nyssa sinensis）KAA8543655.1、油橄欖（Olea europaea var. sylvestris）XP_007146890.1、小?？Х龋–offea arabica）XP_027083154.1和長葉杜莖山（Maesa lanceolata）AHF22089.1，氨基酸序列相似性為78～87%。其中，CsCYP79A1蛋白氨基酸序列與中華獼猴桃TXG46886.1的相似性最高，達(dá)87%。使用DNAMAN 6.0對CsCYP79A1蛋白及其7個同源蛋白和1個擬南芥CYP79A2（Arabidopsis thaliana，AAF-70255.1）共9個蛋白進(jìn)行氨基酸序列同源比對，結(jié)果如圖3所示。這9個蛋白均具有P450典型的保守序列：K-螺旋（ExxR）、PERF結(jié)構(gòu)域（PxRx）和血紅素結(jié)合域（FxxGxxxCxG）（曹運鵬等，2016）。

為進(jìn)一步了解茶樹CsCYP79A1與其他植物之間的進(jìn)化關(guān)系，用同源比對得到的水稻（Oryza sativa）XP_015633853.1及上述8個蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖4所示。CsCYP79A1與中華獼猴桃、原葉杜鵑和長葉杜莖山的同源蛋白親緣關(guān)系較近，與擬南芥和水稻的蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 3 CsCYP79A1蛋白理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

通過ProtParam預(yù)測茶樹CsCYP79A1蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，CsCYP79A1蛋白分子式為C2752H4375N7370772S29，相對分子質(zhì)量為61.07 kD，理論等電點（pI）為7.64，由538個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸（Leu）占比最高，為11.5%，色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）占比較低，均為1.5%;不穩(wěn)定指數(shù)43.37，脂肪指數(shù)96.75，總平均疏水性值-0.122，為不穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白。

使用ProtScale對CsCYP79A1蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。疏水性最大值為2.911，位于第22位氨基酸，疏水性最小值為-2.711，位于第157位氨基酸，第0～50位氨基酸和第450～500位氨基酸均有1個典型的疏水性區(qū)域，在這些區(qū)域均存在一個跨膜結(jié)構(gòu)，與TMHMM預(yù)測的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。TMHMM預(yù)測結(jié)果（圖6）顯示，CsCYP79A1蛋白的1～3位氨基酸位于細(xì)胞膜外，4～27位氨基酸之間有一個跨膜螺旋區(qū)，28～474位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi)，474～497位氨基酸有一個跨膜螺旋區(qū)，497～538位氨基酸位于細(xì)胞膜外，推測CsCYP79A1蛋白是一個與細(xì)胞信號傳遞有關(guān)的膜受體蛋白。SignalP預(yù)測結(jié)果顯示，CsCYP79A1蛋白無信號肽。

使用NetPhos 3.1 Server對CsCYP79A1蛋白的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖7）顯示，CsCYP79A1蛋白多肽鏈上共有40個磷酸化位點，占氨基酸序列的7.4%，其中21個絲氨酸（Ser）位點，14個蘇氨酸（Thr）位點和5個酪氨酸（Tyr）位點，主要能被蛋白激酶C（PKC）、細(xì)胞分裂周期蛋白2（cdc2）和酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）等蛋白激酶磷酸化。

2. 4 CsCYP79A1蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

使用SOPMA對CsCYP79A1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖8所示。CsCYP79A1蛋白含有264個α-螺旋、23個β轉(zhuǎn)角、63個延伸鏈和188個無規(guī)則卷曲，分別占氨基酸序列的49.07%、4.28%、11.71%和34.94%?；阼F銹醇合酶的晶體結(jié)構(gòu)（5ylw.1.A）對CsCYP79A1蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果（圖9）顯示，二者相似度為26.61%。

2. 5 CsCYP79A1基因表達(dá)分析結(jié)果

為探究CsCYP79A1基因在茶樹葉片受傷害過程中的生物學(xué)功能和調(diào)控機制，對不同茶樹品種的第3葉進(jìn)行4次搖青處理后，檢測其CsCYP79A1基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖10-A所示。在相同創(chuàng)傷程度下，金萱第3葉中的CsCYP79A1基因表達(dá)量顯著高于其他品種（P<0.05，下同），其次為黃觀音，與浙農(nóng)113無顯著差異（P>0.05，下同），白葉1號和福鼎大白茶第3葉中CsCYP79A1基因的表達(dá)量顯著低于其他品種，說明CsCYP79A1基因在適制烏龍茶的茶樹品種第3葉中的表達(dá)量較高。

對不同嫩度的黃觀音葉片進(jìn)行4次搖青處理后，檢測CsCYP79A1基因的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖10-B所示。在相同創(chuàng)傷程度下，CsCYP79A1基因在第3葉、第1葉和頂芽中的相對表達(dá)量均存在顯著差異，其中以第3葉的相對表達(dá)量最高，以頂芽的相對表達(dá)量最低。

對CsCYP79A1基因在不同搖青次數(shù)（即不同創(chuàng)傷程度下）葉片中的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖10-C所示。CsCYP79A1基因的表達(dá)量隨搖青次數(shù)的增加呈先升高后降低的變化趨勢，6次搖青葉中該基因的相對表達(dá)量最高，顯著高于其他次數(shù)搖青葉;4次搖青葉中該基因的表達(dá)量高于8次搖青葉，但無顯著差異，2次搖青葉中該基因的表達(dá)量高于0次搖青葉，但無顯著差異。

2. 6 茶樹葉片中苯乙腈的釋放量測定結(jié)果

對不同嫩度葉片及不同搖青次數(shù)葉片中苯乙腈釋放量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖11所示。4次搖青處理后，第3葉會釋放大量苯乙腈，峰面積達(dá)2.8×106，而第1葉釋放少量苯乙腈，頂芽不釋放苯乙腈（圖11-A），表明苯乙腈在不同嫩度葉片中的釋放量與Cs-CYP79A1基因表達(dá)特性一致，均為第3葉最高。此外，苯乙腈的釋放量隨搖青處理次數(shù)的增加呈逐漸升高趨勢，當(dāng)搖青次數(shù)為8次時，苯乙腈釋放量為最大值，峰面積達(dá)4.7×106，顯著高于其他搖青次數(shù)葉片的苯乙腈釋放量（圖11-B）。

3 討論

本研究從茶樹葉片中克隆獲得與苯乙腈合成有關(guān)的CsCYP79A1基因，該基因的CDS長度為1617 bp，共編碼538個氨基酸，含有CYP酶系特征序列：K-螺旋（ExxR）、PERF結(jié)構(gòu)域（PxRx）和血紅素結(jié)合域（FxxGxxxCxG）。目前，對CYP79家族基因的研究多集中在硫代葡萄糖苷、生氰糖苷類和腈類的生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控（Schuler and Werck-Reichhart，2003;宋傲男等，2013;Yuta and Yasuhisa，2014;王軍偉等，2019）。CYP79家族基因大多參與氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)乙醛肟的反應(yīng)調(diào)控，如CYP79A2基因能調(diào)控苯丙氨酸向芳香族乙醛肟的轉(zhuǎn)化，CYP79B1、CYP79B2和CYP79B3基因能調(diào)控色氨酸轉(zhuǎn)化為3-吲哚-乙醛肟，CYP79F1和CYP79F2基因能調(diào)控甲硫氨酸衍生成脂肪族乙醛肟（Chen et al.，2003;宋傲男等，2013）;也有研究表明CYP79家族基因中部分基因參與多種乙醛肟類化合物轉(zhuǎn)化（Luck et al.，2017）。雖然本研究已證實CsCYP79A1基因與苯乙腈的合成有關(guān)，但是否參與苯丙氨酸向苯乙醛肟的轉(zhuǎn)化還有待深入研究。

烏龍茶是中國六大茶類之一，具有馥郁的花果香氣，其特殊香氣的形成取決于搖青工藝（王贊和郭雅玲，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著搖青處理次數(shù)的增加，CsCYP79A1基因的表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢，6次搖青葉中該基因相對表達(dá)量最高。茶樹基因表達(dá)庫數(shù)據(jù)顯示，隨著茉莉酸甲酯（MeJA）對葉片處理時間的增加，CsCYP79A1基因表達(dá)量也呈先升高后降低的變化趨勢，在處理24 h時相對表達(dá)量最高（Xia et al.，2019，2020），與本研究結(jié)果相似。已有研究表明，連續(xù)機械損傷也誘導(dǎo)其他香氣相關(guān)基因的表達(dá)，如橙花叔醇合酶基因CsNES、色氨酸合酶基因CsTSA和芳樟醇合酶基因CsLISs（Zeng et al.，2016;Xin et al.，2017;Zhou et al.，2017）。實際生產(chǎn)中，不同搖青程度（搖青時間和搖青次數(shù)）的烏龍茶的香氣滋味均存在明顯差異，且有研究顯示搖青程度加強，苯乙腈相對含量也隨之升高（林鄭和等，2015），但也有研究顯示東方美人茶中苯乙腈相對含量低于凍頂烏龍茶，而凍頂烏龍茶低于文山包種茶，究其原因是這3種茶的搖青程度不同導(dǎo)致，即搖青程度：東方美人茶>凍頂烏龍茶>文山包種茶（廉明等，2015），說明茶葉中苯乙腈相對含量受茶葉原料、制作工藝等多重影響。

本研究分析搖青處理對不同茶樹品種葉片CsCYP79A1基因的影響，結(jié)果顯示，4次搖青處理后，金萱和黃觀音葉片中的CsCYP79A1基因表達(dá)量高于浙農(nóng)113、白葉1號和福鼎大白茶，說明在適制烏龍茶品種中的CsCYP79A1基因表達(dá)量較高。前人研究結(jié)果表明，不同嫩度葉片中的創(chuàng)傷防御體系不同（林毅芳和許信泉，2008;Ant?nio et al.，2013;Fang et al.，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)，CsCYP79A1基因在第3葉中的相對表達(dá)量顯著高于第1葉和頂芽，該結(jié)果從分子層面證實烏龍茶的制作原料應(yīng)為具有一定成熟度的葉片。一般認(rèn)為，茶樹品種是茶葉品質(zhì)特征形成的基礎(chǔ)，不同品種加工成同類的茶葉也存在差異。對茶樹品種的適制性研究主要集中于茶樹嫩梢的物理特性和化學(xué)特性，烏龍茶適制品種評價指標(biāo)包括葉寬、葉厚、柵欄組織厚度等8項性狀（楊偉麗等，1993;張續(xù)周和周艷華，2020）。今后應(yīng)深入挖掘參與茶樹防御響應(yīng)機制的基因，研究其在烏龍茶制作過程中的變化規(guī)律。

4 結(jié)論

CsCYP79A1基因表達(dá)量與茶樹品種、葉片嫩度和搖青次數(shù)密切相關(guān)，且其表達(dá)量和苯乙腈釋放量均為第3葉最高，故推測CsCYP79A1基因是苯乙腈合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）