李慶榮 廖森泰 邢東旭 肖陽 趙超藝 楊瓊

摘要：【目的】蠶沙中不僅富含營養(yǎng)物質(zhì)，還含有大量微生物資源，篩選出蠶沙中的高效解磷菌并對(duì)其解磷機(jī)理進(jìn)行探討，為微生物肥料的開發(fā)利用提供資源?！痉椒ā恳愿邷匕l(fā)酵期的蠶沙為材料，通過無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基定向篩選獲得耐高溫的解磷菌1株;通過生理生化及分子生物學(xué)方法進(jìn)行分類鑒定;利用鉬銻抗比色法和高效液相色譜法進(jìn)行有效磷和有機(jī)酸含量的定量分析;通過SPSS 11.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?！窘Y(jié)果】從高溫堆肥發(fā)酵過程中的蠶沙中篩選獲得1株白色圓形菌落的菌株，菌體長桿狀、革蘭氏染色陽性;通過基因組測(cè)序獲得其全長基因組大小為5324477 bp，GC含量為37.73%，37個(gè)Scaffolds，73個(gè)Contigs，注釋基因5628個(gè)、tRNA 48個(gè)及rRNA 1個(gè);基因組序列比對(duì)分析鑒定為巨大芽孢桿菌，命名為SEM-5。該菌株具有較強(qiáng)的耐受鹽（NaCl濃度≤10%）堿（pH 5～10）及高溫（60 ℃）能力;對(duì)不同無機(jī)磷的解磷效果不同，其中對(duì)鈣鹽來源的無機(jī)磷溶解效率顯著高于磷酸鋁和磷酸鐵（P<0.05，下同）。對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間SEM-5菌株發(fā)酵液的有效磷濃度、有機(jī)酸含量和發(fā)酵液pH等進(jìn)行檢測(cè)及相關(guān)分析，結(jié)果表明不同發(fā)酵時(shí)間的SEM-5菌株發(fā)酵液中有效磷濃度與不同有機(jī)酸的相關(guān)性不同;在0～14 d的發(fā)酵過程中，有效磷濃度與乙酸和酒石酸含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與乳酸、琥珀酸和丙酸含量呈顯著正相關(guān);與發(fā)酵液pH和草酸含量分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)，與蘋果酸和檸檬酸含量則無顯著相關(guān)性（P>0.05）。【結(jié)論】分離自蠶沙的巨大芽孢桿菌（SEM-5菌株）具有很好的環(huán)境適應(yīng)性，耐鹽堿和高溫，且能高效地溶解釋放鈣鹽中的磷元素，具有良好的微生物肥料開發(fā)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞： 蠶沙;巨大芽孢桿菌;解磷菌;分離鑒定;有機(jī)酸

中圖分類號(hào)： S879.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）03-0797-09

Isolation and identification of phosphate-solubilizing strain SEM-5 from silkworm excrement and its phosphorus dissolution function

LI Qing-rong1，2， LIAO Sen-tai1， XING Dong-xu1，2， XIAO Yang1，

ZHAO Chao-yi1*， YANG Qiong1，2*

（1The Sericulture and Agri-food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou? 510610，China; 2Key Laboratory of Urban Agriculture in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Guangzhou? 510610， China）

Abstract：【Objective】Silkworm excrement is not only rich in nutrients，but also a variety of functional microorga-nisms. In this study，in order to provide resources for the development and utilization of microbial fertilizer，some high efficient phosphate dissolving bacteriawere screened and its phosphate dissolving mechanism was discussed preliminarily. 【Method】A high temperature resistant strain with high efficiency of inorganic phosphorus hydrolysis was screened from the silkworm excrement through the inorganic phosphorus screening medium，and classified using the methods of physio-logy，biochemistry and molecular biology; the soluble phosphorus and the organic acid contents were quantitatively determined by the methods of the molybdenum antimony anti colorimetry and the high performance liquid chromatography（HPLC），respectively. The relevant data was statistical analyzed by the SPSS statistics software. 【Result】A strain was screened from silkworm excrement during high temperature composting fermentation. The strain was white round colony，rod-shaped and gram positive. Full-length genome sequence was obtained by genome sequencing. The genome size was 5324477 bp， GC content was 37.73%，37 Scaffolds，73 Contigs， a total of 5628 genes were predicted along with 48 tRNAs and one rRNA. It was classified as Bacillus megaterium，named SEM-5，which had a marked function of dissolving inorganic phosphorus and strong tolerance of salt（NaCl concentration≤10%），alkali（pH 5-10） and high temperature（60）. The result showed that the dissolving inorganic phosphorus ability of the strain on different sources was diffe-rent. The dissolution efficiency of inorganic phosphorus from calcium salt was significantly higher than that of aluminum phosphate and iron phosphate（P<0.05， the same below）. The data of available phosphorus concentration，organic acid and pH of SEM-5 strain fermentation broth in different fermentation times were detected and analyzed，and correlation analysis showed that the correlation between the concentration of soluble phosphorus and different organic acids was different in different fermentation times. The concentration of soluble phosphorus in fermentation broth had an extremely significant positive correlation with the content of acetic acid and tartaric acid （P<0.01， the same below），and had a significant positive correlation with the content of lactic acid，succinic acid，propionic acid in fermentation broth， and had a extremely significant negative，significant negative correlation with pH of the fermentation broth and the content of oxalic acid，respectively，but had no significant difference with malic acid and citric acid contents（P>0.05）， from the beginning to day14 of the fermentation. 【Conclusion】B. megaterium isolated from silkworm excrement（strain SEM-5） has good environmental adaptability，including tolerance to salt，alkali and high temperature，and exhibits a good dissolving and releasing ability for inorganic phosphorus from insoluble calcium source. It has a good application potential and development value of microbial fertilizer.

Key words： silkworm excrement; Bacillus megaterium; phosphate-solubilizing bacteria; isolation and identification; organic acid

Foundation item： Key-area Research and Development Project of Guangdong（2018B020206001）; General Project of Guangzhou Science Research（201904010086）; Team Building Project of Guangdong Academy of Agricultural Scien-ces in the 13th Five-Year Plan Period（201801xx）

0 引言

【研究意義】磷是植物生長發(fā)育所必需的大量元素，也是植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和酶等多種重要化合物的組成元素，在光合作用、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、呼吸代謝及大分子生物合成等主要代謝過程中均具有重要作用（Rodríguez and Fraga，1999;Elser，2012;Anand et al.，2016;Wu et al.，2019）。我國大部分的土壤都缺乏足夠的可供作物吸收利用的有效磷（向萬勝等，2004）。土壤磷素供給不足是制約作物生長發(fā)育的主要原因之一?；罨寥乐械碾y溶性磷和增強(qiáng)土壤有效磷的供給能力一直是人們關(guān)注的重要問題，確保對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。已有研究表明，在合適的理化因素和微生物的作用下，土壤中的難溶性磷、鉀等礦物質(zhì)可被釋放出來，提升土壤肥力，促進(jìn)植物吸收營養(yǎng)物質(zhì)（Alori et al.，2017;Gouda et al.，2018）。有效利用微生物對(duì)土壤礦物質(zhì)進(jìn)行分解，已成為提高土壤肥力有效化利用的重要途徑之一，但不同微生物對(duì)不同礦物質(zhì)的降解效率有所差異，因此有目的地分離鑒定高效溶磷菌株，可為微生物肥料的開發(fā)利用提供資源，對(duì)當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中降低化肥使用量并提高化肥利用效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物與土壤磷之間的關(guān)系研究始于20世紀(jì)初，Sackett等（1908）發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌可將不溶的天然磷礦石溶解利用，這類可將土壤中難以利用的磷酸鹽分解為植物能吸收的有效磷的微生物被稱為解磷微生物。我國對(duì)解磷微生物的研究始于20世紀(jì)50年代（馮月紅等，2003），至今越來越多的微生物菌株被發(fā)現(xiàn)具有溶解釋放礦物質(zhì)磷的潛力。已報(bào)道的解磷菌包括解磷細(xì)菌、解磷真菌和解磷放線菌等，主要來源于不同作物根際土壤（王浩等，2014;魏偉等，2014;柯春亮等，2015;邢芳芳等，2016;徐歡等，2016），也有分離自藥渣、酒糟等廢棄物（王明歡等，2020;張芮瑞等，2020）。在土壤中，解磷細(xì)菌占解磷微生物總量的1%～50%，主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobcterium）、微球菌屬（Micrococcus）、固氮菌屬（Azotobacter）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、歐文氏菌屬（Erwinia）和沙雷氏菌屬（Serratia）等（Rodríguez et al.，2001;Vyas and Gulati，2009;Liu et al.，2012;Nosrati et al.，2014;Behera et al.，2017）。解磷微生物的解磷過程十分復(fù)雜，機(jī)制多樣（Zhu et al.，2018），主要包括：（1）微生物產(chǎn)生有機(jī)酸解磷，有機(jī)酸解磷是最主要的解磷方式，一方面有機(jī)酸的分泌可降低pH，另一方面有機(jī)酸通過與金屬離子的螯合作用而促進(jìn)磷酸根被釋放（Cunningham and Kuia-ck，1992;Kim et al.，1997），但不同解磷菌株分泌釋放的有機(jī)酸種類與數(shù)量存在差異，解磷能力也不同（秦利均等，2019）。（2）微生物代謝釋放CO2和H+，降低其生長環(huán)境的pH，從而促使不溶性磷被溶出，朱培淼等（2007）研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH降低與解磷菌的解磷能力相關(guān)性很高。（3）微生物代謝分泌相關(guān)酶的酶解作用，酶解也是相當(dāng)重要的一個(gè)解磷機(jī)制，細(xì)胞分泌出的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及植酸酶等可加速有機(jī)化合物分解，從而促進(jìn)有機(jī)磷釋放。此外，Ghani等（1994）報(bào)道認(rèn)為H2S等的產(chǎn)生，也會(huì)促進(jìn)磷酸根釋放?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蠶沙是養(yǎng)蠶過程中的主要廢棄物，不僅富含營養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的微生物菌群，包括大量解磷、解鉀、固氮、拮抗及降解有機(jī)物等功能的菌株，顯示出明顯的微生物多樣性（Li et al.，2018），但目前關(guān)于蠶沙中微生物的研究利用較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】以堆肥發(fā)酵的蠶沙為材料，通過微生物培育技術(shù)篩選并分離蠶沙中的高效解磷菌株，對(duì)其生理生化特性及其溶磷作用進(jìn)行探討，解析影響菌株溶磷效率的因素，旨在為微生物肥料的開發(fā)利用提供資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

蠶沙原料由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所在家蠶品種資源繁育過程中收集，經(jīng)好氧堆肥發(fā)酵腐熟。蠶沙樣品即為好氧堆肥發(fā)酵的高溫期樣品。巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，編號(hào)GW-1-0201-1305-04）購自廣州市微元生物科技有限公司。草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海麥克林生化科技有限公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒（TaKaRa，貨號(hào)：DV810A）購自寶生物工程（大連）有限公司。主要儀器設(shè)備：LC-100高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）和反相色譜柱（月旭AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）。

無機(jī)磷選擇性培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.2。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.4。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2～7.4。

1. 2 菌株分離

蠶沙樣品參照Li等（2018）的方法進(jìn)行稀釋。各取100 μL不同級(jí)稀釋液涂板在無機(jī)磷選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d。挑選長勢(shì)良好的單個(gè)菌落，在NA培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線分離純化2代。純化后的菌株保存在NA斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 菌株基因組序列測(cè)序與分析

將分離得到的菌株分別接種于5 mL NB液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，離心，取沉淀的菌體，根據(jù)TaKaRa細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說明提取菌株的基因組序列，電泳檢測(cè)完整性及純度，委托華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行全基因組序列測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)下機(jī)后，清除掉低質(zhì)量的數(shù)據(jù)和接頭數(shù)據(jù)，獲得Clean data，并用SOAPdenovo（www.soap.genomics.org.cn）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。針對(duì)組裝結(jié)果，分別利用Glimmer、rRNAmmer和tRNAscan進(jìn)行基因注釋、rRNAs和tRNAs序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析與分類預(yù)測(cè)（Ashburner et al.，2000;Kanehisa et al.，2006;Lagesen et al.，2007）。

1. 4 菌株生長特征鑒定

以NA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)整不同培養(yǎng)溫度（30～60 ℃）、培養(yǎng)基pH（4～10）及NaCl濃度（2%～12%），通過測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌液菌體量（OD600 nm），分析溫度、pH和滲透壓（NaCl濃度）對(duì)分離菌生長的影響。

1. 5 菌株對(duì)不同來源無機(jī)磷的溶解

分別以磷酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鋁和磷酸鐵4種無機(jī)磷作為唯一磷源，配制液體無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基，按1%的比例加入活化液體菌株和對(duì)照菌巨大芽孢桿菌（CK），37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d后取樣，6000 r/min離心10 min，取上清液。上清液中的磷濃度采用鉬銻抗比色法檢測(cè)（Rice et al.，1995）。

1. 6 不同發(fā)酵時(shí)間下菌株發(fā)酵液中有效磷及發(fā)酵液pH的變化

菌株接種至以磷酸鈣為唯一磷源的100 mL液體無機(jī)磷培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12和14 d時(shí)取樣，6000 r/min離心10 min，取上清液。上清液pH用pH計(jì)測(cè)定，有效磷濃度用1.5的方法檢測(cè)。

1. 7 不同發(fā)酵時(shí)間下菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸濃度測(cè)定

利用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定菌株不同發(fā)酵時(shí)間上清液中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酸等8種有機(jī)酸的含量。

1. 7. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 首先測(cè)定草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酸等8種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，丙酸測(cè)定是以乙腈和0.02%磷酸水為流動(dòng)相，設(shè)定流速0.7 mL/min，柱溫25 ℃，保留時(shí)間15 min，波長210 nm;其他7種有機(jī)酸以甲醇和磷酸二氫鈉水溶液為流動(dòng)相，設(shè)定流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，保留時(shí)間20 min，波長214 nm。

1. 7. 2 樣品收集與處理 選用磷酸鈣為唯一磷源的篩選培養(yǎng)基作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同發(fā)酵時(shí)間（0、2、4、6，8、10、12和14 d）下取樣，離心收集上清液，用0.22 μm針頭式過濾器過濾到樣品瓶內(nèi)，按不同有機(jī)酸測(cè)定方法測(cè)定樣品溶液中的8種有機(jī)酸濃度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 11.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、制圖及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株的分離鑒定結(jié)果

對(duì)堆肥發(fā)酵過程中的蠶沙取樣處理后，通過無機(jī)磷篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)溶磷圈大小、菌株形態(tài)等獲得1株在無機(jī)磷培養(yǎng)基上生長良好、溶磷圈明顯的菌株，將其命名為SEM-5。該菌株的菌落呈白色，圓形或橢圓形，表面光滑，菌體長桿狀，革蘭氏染色結(jié)果表明其為革蘭氏陽性菌（圖1）。

2. 2 SEM-5菌株的基因組序列特征

通過Illumina HiSeq 4000平臺(tái)測(cè)序，從SEM-5菌株共測(cè)得650 Mb的測(cè)序數(shù)據(jù)?；跍y(cè)序數(shù)據(jù)組裝得知，SEM-5菌株基因組大小為5324477 bp，GC含量為37.73%，共有37個(gè)Scaffolds和73個(gè)Contigs?；蚪M組分分析發(fā)現(xiàn)，SEM-5菌株的基因組含有5628個(gè)基因、tRNA 48個(gè)及rRNA 1個(gè)（圖2），測(cè)序組裝分析結(jié)果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，提交編碼：No. NGUM-00000000。測(cè)序組裝序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析，鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（B. megaterium）。

2. 3 SEM-5菌株的生長特性

以NA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過檢測(cè)不同生長時(shí)間OD600 nm的變化，分析不同生長溫度、pH及NaCl濃度對(duì)SEM-5菌株生長的影響，結(jié)果表明該菌株生長適應(yīng)性很強(qiáng)。SEM-5菌株的最適生長pH范圍為6～8，但耐受pH范圍在5～10，過酸的環(huán)境下（pH 4）菌株難以增殖（圖3-A）;在檢測(cè)的NaCl濃度范圍內(nèi)，2%濃度下菌株的增殖速度最快，隨著濃度升高，菌株增殖速度降低，直至10%濃度下仍可生長繁殖，但超過該濃度后，菌株難以增殖（圖3-B）;SEM-5菌株的最適生長溫度范圍為30～40 ℃，但在60 ℃高溫下仍可生長（圖3-C）。

2. 4 SEM-5菌株對(duì)不同來源無機(jī)磷溶解能力的測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，SEM-5菌株對(duì)磷酸氫鈣和磷酸鈣的溶解能力較強(qiáng)，培養(yǎng)基上清液中有效磷濃度分別達(dá)524.2和235.5 mg/L，對(duì)磷酸鋁中也有一定的溶解釋放能力。以磷酸氫鈣和磷酸鋁為磷源時(shí)SEM-5菌株發(fā)酵上清液中的有效磷濃度極顯著高于對(duì)照菌（P<0.01，下同），以磷酸鈣為磷源時(shí)其有效磷濃度顯著高于對(duì)照菌（P<0.05，下同）;但在以磷酸鐵為唯一磷源的培養(yǎng)基中，SEM-5菌株和對(duì)照菌的發(fā)酵上清液中有效磷濃度近乎為0。

2. 5 不同發(fā)酵時(shí)間下SEM-5菌株生長曲線、發(fā)酵液pH及其對(duì)磷酸鈣溶解能力的測(cè)定結(jié)果

以磷酸鈣為磷源，連續(xù)發(fā)酵SEM-5菌株，一部分樣品通過比濁法定時(shí)檢測(cè)OD600 nm，分析發(fā)酵液中SEM-5菌株的生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD600 nm在發(fā)酵第4 d時(shí)達(dá)最高值，且在第8 d后又有一定程度的升高（圖5-A）;一部分樣品進(jìn)行離心，測(cè)定發(fā)酵液中的pH和有效磷濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，在發(fā)酵第2～4 d時(shí)達(dá)最低值（pH 5.4），在第6 d開始上升至5.8，維持該pH至第14 d無明顯變化（圖5-B）;在菌株發(fā)酵第4 d時(shí)發(fā)酵液中的有效磷濃度達(dá)最高值233.3±13.5 mg/L，之后開始緩慢下降（圖5-C）。

2. 6 不同發(fā)酵時(shí)間下SEM-5菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸含量的變化

利用HPLC法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間下SEM-5菌株發(fā)酵液中8種有機(jī)酸的含量，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)各種有機(jī)酸分泌量均隨發(fā)酵時(shí)間的變化而變化，其中乙酸和乳酸含量最高，在發(fā)酵第4 d分別達(dá)1413.57和1196.03 mg/L，并在第8 d降至最低，在發(fā)酵液中含量的變化規(guī)律與SEM-5菌株發(fā)酵生長的OD600 nm相似;琥珀酸、酒石酸、丙酸和蘋果酸也有類似的規(guī)律，但在發(fā)酵液中的含量低于乙酸和乳酸;檸檬酸和草酸在發(fā)酵液中的含量變化規(guī)律與此不同，基本表現(xiàn)為緩慢升高趨勢(shì)。

2. 7 SEM-5菌株有效磷釋放影響因素相關(guān)分析結(jié)果

由表1可知，在0～8 d的發(fā)酵過程中，SEM-5菌株發(fā)酵液中有效磷濃度與檸檬酸、酒石酸含量和OD600 nm呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)酵液pH呈極顯著負(fù)相關(guān)，與發(fā)酵液中乳酸、琥珀酸和乙酸含量呈顯著正相關(guān)，與草酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而蘋果酸和丙酸含量與該發(fā)酵時(shí)間內(nèi)的有效磷釋放無顯著相關(guān)性（P>0.05，下同）。在8～14 d的發(fā)酵過程中，SEM-5菌株發(fā)酵液中有效磷濃度與酒石酸和丙酸含量呈顯著正相關(guān)，與草酸和檸檬酸含量分別呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，但與蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸含量、pH和OD600 nm無顯著相關(guān)性。在0～14 d的發(fā)酵過程中，SEM-5菌株發(fā)酵液中有效磷濃度與酒石酸、乙酸含量及OD600 nm呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)酵液pH呈極顯著負(fù)相關(guān)，與乳酸、琥珀酸和丙酸含量及所測(cè)有機(jī)酸總量呈顯著正相關(guān)，與蘋果酸和檸檬酸含量無顯著相關(guān)性。

3 討論

磷是植物生長所需的一種主要營養(yǎng)元素，但土壤中大部分磷不能被植物吸收利用，而嚴(yán)重影響植物生長。解磷菌能將植物難以吸收利用的難溶性或不溶性磷轉(zhuǎn)化為可利用形態(tài)，提高土壤中磷素利用效率，可有效減少化學(xué)肥料施用。但不同微生物菌株對(duì)不同磷源的磷溶解效率差異明顯，選擇高效的解磷菌株并有針對(duì)性地用于不同環(huán)境是解磷菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。本研究篩選獲得的SEM-5菌株具有很強(qiáng)的釋放磷酸鈣和磷酸氫鈣中磷素的能力，而對(duì)磷酸鐵中的磷酸釋放能力相對(duì)較弱。由于我國不同地域的土壤中礦物質(zhì)磷成分不同，大多數(shù)是以鈣鹽的形式存在，因此，SEM-5菌株在無機(jī)磷以鈣鹽為主要存在形式的區(qū)域可能有良好的應(yīng)用前景。

微生物溶磷機(jī)理較復(fù)雜，研究顯示解無機(jī)磷細(xì)菌多與分泌有機(jī)酸有關(guān)（Sane and Mehta，2015）。秦利均等（2019）對(duì)溶磷菌的解磷機(jī)制進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)已報(bào)道溶磷菌產(chǎn)生的小分子有機(jī)酸種類繁多，包括葡萄糖酸、草酸、乳酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸等，且微生物菌種不同，其產(chǎn)酸的種類與含量及溶磷能力也各不相同，其中芽孢桿菌類解磷菌主要產(chǎn)生乙酸、檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸和葡萄糖酸等。本研究對(duì)SEM-5菌株分泌的8種小分子有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)及相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時(shí)間的SEM-5菌株發(fā)酵液中有效磷濃度與不同有機(jī)酸的相關(guān)性不同，進(jìn)一步證實(shí)解無機(jī)磷細(xì)菌分泌有機(jī)酸與無機(jī)磷溶解的復(fù)雜關(guān)系。發(fā)酵液中的檸檬酸含量在14 d發(fā)酵過程中呈緩慢上升趨勢(shì)，發(fā)酵液中有效磷則呈先上升后緩慢下降的變化趨勢(shì)，因此分段分析后發(fā)現(xiàn)，在0～8 d的發(fā)酵過程中檸檬酸含量與發(fā)酵液中有效磷濃度呈極顯著正相關(guān)，在8～14 d的發(fā)酵過程中則呈極顯著負(fù)相關(guān)，而在0～14 d的發(fā)酵過程中顯示無顯著相關(guān)性;丙酸則相反，在0～8 d的發(fā)酵過程中其含量與發(fā)酵液中有效磷濃度無顯著相關(guān)性，但在8～14 d和0～14 d的發(fā)酵過程中呈顯著正相關(guān)。綜合分析整個(gè)發(fā)酵過程（0～14 d）發(fā)現(xiàn)，酒石酸和乙酸對(duì)發(fā)酵液中有效磷的釋放可能貢獻(xiàn)最大，呈極顯著正相關(guān)。此外，葡萄糖酸和奎寧酸未在SEM-5菌株發(fā)酵液中檢測(cè)到，與秦利均等（2019）總結(jié)的芽孢桿菌類菌株分泌的有機(jī)酸略有不同，但也充分說明微生物菌株解磷機(jī)理的復(fù)雜性，即使是同樣的酸解原理，也會(huì)因菌株種類不同而存在差異，與Deubel等（2000）的研究結(jié)果一致。此外，因SEM-5菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，發(fā)酵液pH呈酸性，與有效磷濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與趙小蓉等（2003）、李海云等（2018）的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

SEM-5菌株具有很好的環(huán)境適應(yīng)性，耐鹽堿和高溫，且能高效溶解釋放鈣鹽中的磷元素，具有良好的微生物肥料開發(fā)應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

馮月紅，姚拓，龍瑞軍. 2003. 土壤解磷菌研究進(jìn)展[J]. 草原與草坪，（1）：3-7. doi：10.13817/j.cnki.cyycp.2003.01.001. [Feng Y H，Yao T，Long R J. 2003. Research progress of phosphate-dissolving microorganisms in plant rhizosphere[J]. Grassland and Turf，（1）：3-7.]

柯春亮，陳宇豐，周登博，黃綿佳，張錫炎，高祝芬. 2015. 香蕉根際土壤解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及解磷能力[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，42（6）：1032-1042. doi：10.13344/j.microbiol.china.140684. [Ke C L，Chen Y F，Zhou D B，Huang M J，Zhang X Y，Gao Z F. 2015. Isolation，identification and phosphate solubilization analysis of phosphate-solubilizing bacteria derived from banana rhizosphere soil[J]. Microbiology China，42（6）：1032-1042.]

李海云，姚拓，張榕，張潔，李智燕，榮良燕，路曉雯，楊曉蕾，夏東慧，羅慧琴. 2018. 紅三葉根際溶磷菌株分泌有機(jī)酸與溶磷能力的相關(guān)性研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，27（12）：113-121. doi：10.11686/cyxb2018066. [Li H Y，Yao T，Zhang R，Zhang J，Li Z Y，Rong L Y，Lu X W，Yang X L，Xia D H，Luo H Q. 2018. Relationship between organic acids secreted from rhizosphere phosphate-solubilizing bacteria in Trifolium pratense and phosphate-solubilizing ability[J]. Acta Prataculturae Sinica，27（12）：113-121.]

秦利均，楊永柱，楊星勇. 2019. 土壤溶磷微生物溶磷、解磷機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究，23（1）：59-64. doi：10.16605/ j.cnki.1007-7847.2019.01.009. [Qin L J，Yang Y Z，Yang X Y. 2019. Advances in mechanisms of soil solubilization and dissolution by phosphate solubilizing microorganisms[J]. Life Science Research，23（1）：59-64.]

王浩，姜妍，劉偉，李遠(yuǎn)明，于佳，王紹東. 2014. 大豆根際高效溶磷菌株的分離及溶磷能力分析[J]. 大豆科學(xué)，33（3）：404-407. [Wang H，Jiang Y，Liu W，Li Y M，Yu J，Wang S D. 2014. Isolation and analysis on ability of phosphate dissolving bacteria in rhizosphere of soybean[J]. Soybean Science，33（3）：404-407.]

王明歡，張小娜，林冰，鄧錦輝，張英. 2020. 中藥藥渣中固氮菌、解磷菌、解鉀菌的篩選[J]. 中成藥，42（2）：531-533. doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2020.02.053. [Wang M H，Zhang X N，Lin B，Deng J H，Zhang Y. 2020. Screening of nitrogen-fixing bacteria，phosphorus dissolving bacteria and potassium dissolving bacteria in the residue[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，42（2）：531-533.]

魏偉，吳小芹，喬歡. 2014. 馬尾松根際高效解磷真菌的篩選鑒定及其促生效應(yīng)[J]. 林業(yè)科學(xué)，50（9）：82-88. doi：10. 11707/j.1001-7488.20140911. [Wei W，Wu X Q，Qiao H. 2014. Screening and identification of phosphate-solubili-zing fungi of Pinus massoniana rhizosphere and its application[J]. Scientia Silvae Sinicae，50（9）：82-88.]

向萬勝，黃敏，李學(xué)垣. 2004. 土壤磷素的化學(xué)組分及其植物有效性[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，10（6）：663-670. doi：10. 3321/j.issn：1008-505X.2004.06.021. [Xiang W S，Huang M，Li X Y. 2004. Progress on fractioning of soil phosphorous and availability of various phosphorous fractions to crops in soil[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science，10（6）：663-670.]

邢芳芳，高明夫，禚優(yōu)優(yōu)，胡兆平，李新柱. 2016. 大麥根際高效溶磷菌的篩選、鑒定及促生效果研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，31（S1）：252-257. [Xing F F，Gao M F，Zhuo Y Y，Hu Z P，Li X Z. 2016. Screening and identification of phosphate solubilizing bacteria in Hordeum vulgare rhizosphere and its growth promoting effect[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，31（S1）：252-257.]

徐歡，俞新玲，林勇明，吳承禎，謝安強(qiáng)，陳燦，李鍵，洪滔. 2016. 桉樹根際土壤解磷細(xì)菌的分離、篩選及其解磷效果[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），45（5）：529-535. doi：10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2016.05.009. [Xu H，Yu X L，Lin Y M，Wu C Z，Xie A Q，Chen C，Li J，Hong T. 2016. Isolation，screening of phosphate solubilizing capacity of phosphate solubilizing bacteria in Eucalyptus species[J]. Journal of Fujian Agriculture and Fo-restry University（Natural Science Edition），45（5）：529-535.]

張芮瑞，邱樹毅，周少奇，王雪酈. 2020. 丟糟和磷礦粉高溫堆肥中耐高溫解磷菌的篩選及性能分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，36（5）：110-119. doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985. 2019-1150. [Zhang R R，Qiu S Y，Zhou S Q，Wang X L. 2020. Screening and performance analysis of high-temperature phosphate-solubilizing microorgams in high temperature compost with phosphate rock and discarded vinasse lost grains[J]. Biotechnology Bulletin，36（5）：110-119.]

趙小蓉，林啟美，李保國. 2003. 微生物溶解磷礦粉能力與pH及分泌有機(jī)酸的關(guān)系[J]. 微生物學(xué)雜志，23（3）：5-7. doi：10.3969/j.issn.1005-7021.2003.03.002. [Zhao X R，Lin Q M，Li B G. 2003. The relationship between rock phosphate solubilization and pH and organic acid production of microorganisms[J]. Journal of Microbiology，23（3）：5-7.]

朱培淼，楊興明，徐陽春，歐陽紅，沈其榮. 2007. 高效解磷細(xì)菌的篩選及其對(duì)玉米苗期生長的促進(jìn)作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，18（1）：107-112. [Zhu P M，Yang X M，Xu Y C，Ouyang H，Shen Q R. 2007. High effective phosphate-solubilizing bacteria：Their isolation and promoting effect on corn seedling growth[J]. Chinese Journal of Applied Ecology，18（1）：107-112.]

Alori E T，Glick B R，Babalola O O. 2017. Microbial phosphorus solubilization and its potential for use in sustaina-ble agriculture[J]. Frontiers in Microbiology，8：971. doi：10.3389/fmicb.2017.00971.

Anand K，Kumari B，MallickM A. 2016. Phosphate solubili-zing microbes：An effective and alternative approach as biofertilizers[J]. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences，8（2）：37-40.

Ashburner M，Ball C A，Blake J A，Botstein D，Butler H，Cherry J M，Davis A P，Dolinski K，Dwight S S，Eppig J T，Harris M A，Hill D P，Issel-Tarver L，Kasarskis A，Lewis S，Matese J C，Richardson J E，Ringwald M，Rubin G M，Sherlock G. 2000. Gene ontology：Tool for the unification of biology[J]. Nature Genetics，25（1）：25-29.

Behera B C，Yadav H，Singh S K，Mishra R R，Sethi B K，Dutta S K，Thatoi H N. 2017. Phosphate solubilization and acid phosphatase activity of Serratia sp. isolated from mangrove soil of Mahanadi river delta，Odisha，India[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，15（1）：169-178. doi：10.1016/j.jgeb.2017.01.003.

Cunningham J E，Kuiack C. 1992. Production of citric and oxa-lic acids and solubilization of calcium phosphate by Penicillium bilaii[J]. Applied and Environmental Microbio-logy，58（5）：1451-1458. doi：10.1128/AEM.58.5.1451-1458. 1992.

Deubel A，GranseeA，Merbach W. 2000. Transformation of organic rhizodepositions by rhizosphere bacteria and its influence on the availability of tertiary calcium phosphate[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，163（4）：387-392. doi：10.1002/1522-2624（200008）163：4<387：：AID-JPLN387>3.0.CO;2-K.

Elser J J. 2012. Phosphorus：A limiting nutrient for humanity？[J]. Current Opinion in Biotechnology，23（6）： 833-838. doi：10.1016/j.copbio.2012.03.001.

Ghani A，Rajan S S S，Lee A. 1994. Enhancement of phosphate rock solubility through biological processes[J]. Soil Biology and Biochemistry，26（1）：127-136. doi：10.1016/ 0038-0717（94）90204-6.

Gouda S，Kerry R G，Das G，Paramithiotis S，Shin H S，Patra J K. 2018. Revitalization of plant growth promoting rhizobacteria for sustainable development in agriculture[J]. Microbiological Research，206：131-140. doi：10.1016/j.micres.2017.08.016.

Kanehisa M，Goto S，Hattori M，Aoki-Kinoshita K F，Itoh M，Kawashima S，Katayama T，Araki M，Hirakawa M. 2006. From genomics to chemical genomics：New developments in KEGG[J]. Nucleic Acids Research，34：354-357. doi：10.1093/nar/gkj102.

Kim K Y，Jordan D，McDonald G A. 1997. Effect of phosphate-solubilizing bacteria and vesicular-arbuscular mycorrhizae on tomato growth and soil microbial activity[J]. Biology and Fertility of Soils，26（2）：79-87. doi：10.1007/s003740050347.

Lagesen K，Hallin P，R?dland E A，Staerfeldt H H，Rognes T，Ussery D W. 2007. RNAmmer：Consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes[J]. Nucleic Acids Research，35（9）：3100-3108. doi：10.1093/nar/gkm160.

Li L，Liao S T，Li W M，Xing D X，Luo G Q，Li Q R，Ye M Q，Xiao Y， Yang Q. 2018. Fingerprint of exhaust gases and database of microbial diversity during silkworm excrement composting[J]. Compast Science & Utilization，26（1）：40-51. doi：10.1080/1065657X.2017.1344593.

Liu W G，He Y Q，Zhang K，F(xiàn)an J B，Cao H. 2012. Isolation，identification and characterization of a strain of phosphate-solubilizing bacteria from red soil[J]. Acta Microbiologica Sinica，52（3）：326-333.

Nosrati R，Owlia P，Saderi H，Rasooli I，Ali Malboobi M. 2014. Phosphate solubilization characteristics of efficient nitrogen fixing soil Azotobacter strains[J]. Iranian Journal of Microbiology，6（4）：285-295.

Rice E W，Baird R B，Eaton A D，Clesceri L S. 1995. Standard methods for the examination of water and wastewater，phosphates[M]. Washington DC：American Public Health Association：150-152.

Rodríguez H，F(xiàn)raga R，1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion[J]. Biotechnology Advances，17（4-5）：319-339. doi：10.1016/S0734-9750（99）00014-2.

Rodríguez H，Gonzalez T，Selman G. 2001. Expression of a mineral phosphate solubilizing gene from Erwinia herbi-cola in two rhizobacterial strains[J]. Journal of Biotechnology，84（2）：155-161. doi：10.1016/S0168-1656（00）00347-3.

Sackett W G，Patten A G，Brown C W. 1908. The solvent action of soil bacteria upon the insoluble phosphates of raw bone meal and natural raw rock phosphate[J]. Central Bacteria，20：688-703.

Sane S A，Mehta S K. 2015. Isolation and evaluation of rock phosphate solubilizing fungi as potential biofertilizer[J]. Journal of Fertilizers & Pesticides，6（2）：156-160. doi：10. 4172/2471-2728.1000156.

Vyas P，Gulati A. 2009. Organic acid production in vitro and plant growth promotion in maize under controlled environment by phosphate-solubilizing fluorescent Pseudomonas[J]. BMC Microbiology，9：174. doi：10.1186/1471-2180-9-174.

Wu F，Li J R，Chen Y L，Zhang L P，Zhang Y，Wang S，Shi X，Li L，Liang J S. 2019. Effects of phosphate solubili-zing bacteria on the growth，photosynthesis，and nutrient uptake of Camellia oleifera Abel.[J]. Forests，10（4）：348. doi：10.3390/f10040348.

Zhu J，Li M，Whelan M. 2018. Phosphorus activators contri-bute to legacy phosphorus availability in agricultural soils：A review[J]. Science of the Total Environment，612：522-537. doi：10.1016/j.scitotenv.2017.08.095.

（責(zé)任編輯 羅 麗）