趙淑蘭，占潔，王濤，廖家林，趙明星，黃振興,3*

1(江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無錫恒誠水利工程建設(shè)有限公司，江蘇 無錫，214000)3(江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州，215009)

餐廚垃圾，俗稱“泔腳”，主要是指居民日常生活、食品加工、餐飲服務(wù)、單位供餐等活動中產(chǎn)生的食物廢料和食物殘留[1]。隨著我國居民生活水平的日益提高，餐廚垃圾產(chǎn)生量也隨之增多，已經(jīng)成為我國城市生活垃圾的主要組成部分。按照生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《2019年全國大、中城市固體廢物污染環(huán)境防治年報》數(shù)據(jù)顯示，2018年度全國200個大中型城市的生活垃圾產(chǎn)生量達到21 147.3萬t，其中餐廚垃圾產(chǎn)生量約為1億t/年，到2020年預(yù)計將會突破至1.2億t[2]。

餐廚垃圾經(jīng)精細化分選和三相分離后，餐廚固渣中有機組分主要包括淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素類物質(zhì)[3]。其中，淀粉類有機質(zhì)是生化性非常好的有機碳源。從市政環(huán)境治理整體需求來看，我國污水處理廠普遍存在碳源缺乏問題，需要大量的外加碳源[4]。如能從餐廚固渣中回收碳源用于污水處理脫氮除磷過程，則能有效降低運行成本。然而，超聲、水熱和微波等物化方法很難實現(xiàn)碳源的有效分離[5-6]。酶催化水解技術(shù)具有反應(yīng)專一、效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，能夠定向催化特定物質(zhì)的水解反應(yīng)，從而實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物從固相到液相的定向分離[7-8]。但是目前有關(guān)從餐廚固渣中回收碳源的研究報道較少。鑒于此，本研究采用復(fù)合淀粉酶水解法回收餐廚固渣中的有機碳源，通過單因素實驗考察酶解條件對碳源提取效果的影響，建立關(guān)鍵影響因子的響應(yīng)面回歸模型并分析相互間的交互關(guān)系，明確最佳酶解條件。在此基礎(chǔ)上，借助等電點沉淀法進一步提高回收碳源純度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

餐廚固渣取自于江蘇省張家港市某餐廚垃圾處理廠。餐廚垃圾經(jīng)分質(zhì)分選、制漿和三相分離等預(yù)處理后，餐廚固渣含水率為72.1%(質(zhì)量分數(shù))，揮發(fā)性固體(volatile solid，VS)占總固體(total solid，TS)的質(zhì)量分數(shù)為92.8%。粗蛋白、粗淀粉、粗纖維和粗脂肪占TS的質(zhì)量分數(shù)分別為(38.7±1.7)%、(33.2±1.4)%、(16.5±0.9)%和(1.8±0.2)%。α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶購于酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司，酶活分別為4、35、100 U/mg。3種酶的最佳作用pH值分別為6.0、5.0、5.0；最佳作用溫度分別為60、55、55 ℃。其他試驗試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淀粉酶的篩選

餐廚固渣樣品采集完成后，在105 ℃下烘干并用高速粉碎機粉碎，然后放置密封袋中于4 ℃下保藏待用。稱取20 g餐廚固渣(以TS計)分別加至血清瓶中，用去離子水調(diào)節(jié)底物質(zhì)量濃度至200 g/L，在恒溫搖床中(120 r/min，60 ℃)糊化60 min后，分別加入α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。酶添加質(zhì)量分數(shù)以單位質(zhì)量餐廚固渣(g TS)添加酶量(g)的百分比計。恒溫搖床中(120 r/min)酶解5 h，不添加任何酶的體系為空白對照，不同酶解體系的最適反應(yīng)條件如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后，將血清瓶置于100 ℃水浴鍋中熱處理15 min以滅活淀粉酶，5 000 r/min離心10 min后，提取上清液測定總糖和還原糖質(zhì)量濃度以對比酶解效果。

表1 不同種類淀粉酶的最適酶解條件Table 1 Optimal enzymatic conditions of different kinds of amylase

1.2.2 復(fù)合淀粉酶水解的單因素試驗

在對比不同淀粉酶水解效果的基礎(chǔ)上，選取α-和γ-復(fù)合淀粉酶提取餐廚固渣碳源，并對水解條件進行單因素試驗。以酶添加質(zhì)量分數(shù)、復(fù)合淀粉酶質(zhì)量比(α/γ)、酶解溫度、酶解pH和底物質(zhì)量濃度為自變量，以碳源提取率(E)為響應(yīng)值，研究各因素對碳源提取效果的影響。酶解步驟參照1.2.1，反應(yīng)基本條件為：底物質(zhì)量濃度200 g/L、酶添加質(zhì)量分數(shù)1.0%(以g/g TS計)、復(fù)合淀粉酶質(zhì)量比3∶1、酶解溫度60 ℃和酶解pH 6.0。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果篩選出關(guān)鍵影響因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法進一步優(yōu)化組合反應(yīng)條件。以底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和pH為自變量，以碳源提取率(E)為響應(yīng)值進行中心組合試驗，分析自變量對響應(yīng)值的主效應(yīng)和交互作用。響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素與水平設(shè)計如表2所示。

1.2.4 等電點沉淀法去除蛋白質(zhì)

餐廚固渣經(jīng)復(fù)合淀粉酶處理后所獲得的碳源提取液中，仍然存在一定濃度的可溶性蛋白。為了進一步提高碳源純度，借助等電點沉淀法去除碳源提取液中的蛋白質(zhì)。采用0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)提取液pH值分別至3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75 、5，充分攪拌混合，在25 ℃條件下靜置1 h后，5 000 r/min離心10 min，收集上清液進行測定分析。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.3 分析測試方法

餐廚固渣的TS和VS質(zhì)量分數(shù)測定采用烘干恒重法(HJ 613—2011)；粗淀粉質(zhì)量分數(shù)測定采用酸水解法(GB 5009.9—2016)；蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)；粗脂肪質(zhì)量分數(shù)測定采用索氏抽提法(GB 5009.6—2016)。碳源提取液中總糖質(zhì)量濃度采用苯酚-硫酸法(GB/T 15672—2009)；還原糖質(zhì)量濃度測定采用3,5-二硝基水楊酸法(NY/T 2742—2015)；生化需氧量(biochemical oxygen demand,BOD)的測定采用稀釋接種法(GB/T 7488—1987)。

碳源提取率(E)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：C1，酶解后提取液中總糖的質(zhì)量濃度，g/L；V1，提取液體積，L；M0，餐廚固渣中粗淀粉質(zhì)量分數(shù)，%；W0，餐廚固渣的干重(以TS計)，g。

蛋白質(zhì)去除率(R)的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：P0，提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/L；P1，等電點沉淀后提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類淀粉酶對餐廚固渣碳源的提取效果

淀粉酶是能催化淀粉、糖原水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一群酶的總稱，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[9]。α-淀粉酶作用于淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物包括糊精、低聚糖和單糖；β-淀粉酶是從非還原性末端依次切開相隔的α-1,4-糖苷鍵，當(dāng)作用于直鏈淀粉時，其最終產(chǎn)物主要為麥芽糖。但是β-淀粉酶不能水解和跨過支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，因此水解支鏈淀粉時其最終產(chǎn)物除了麥芽糖還會殘留下大分子的β-極限糊精。γ-淀粉酶也是一種外切酶，從淀粉分子非還原端依次切割α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，逐個切下葡萄糖殘基。無論作用于直鏈淀粉還是支鏈淀粉，γ-淀粉酶的最終產(chǎn)物均為葡萄糖。首先比較分析了3種淀粉酶對餐廚固渣中碳源的最佳水解效果。如圖1所示，餐廚固渣經(jīng)不同淀粉酶處理后，提取液中的總糖質(zhì)量濃度分別為53.8 g/L(α-淀粉酶)、29.0 g/L(β-淀粉酶)和39.5 g/L(γ-淀粉酶)，而對照組僅為15.4 g/L。很顯然，α-淀粉酶最有利于餐廚固渣中淀粉的溶出，碳源提取率達到64.8%。此外，γ-淀粉酶處理后的還原糖質(zhì)量濃度最高，達到21.3 g/L，約占溶解性總糖的53.9%。已有文獻表明，還原糖濃度高說明淀粉水解更為徹底，水解液則更加穩(wěn)定[10]。對比以上3種淀粉酶的水解效果，可以看出α-淀粉酶和γ-淀粉酶的碳源提取率均優(yōu)于β-淀粉酶，而γ-淀粉酶處理后的還原糖濃度要高于α-淀粉酶。因此進一步選取α-淀粉酶和γ-淀粉酶協(xié)同處理餐廚固渣以提高碳源提取效果，并對其復(fù)合酶解條件進行單因素試驗。

2.2 復(fù)合淀粉酶水解餐廚固渣的單因素實驗

2.2.1 酶添加質(zhì)量分數(shù)與α/γ添加質(zhì)量比對碳源提取效果的影響

如圖2-a所示，通過添加復(fù)合淀粉酶能夠有效促進餐廚固渣的碳源提取。當(dāng)復(fù)合酶添加質(zhì)量分數(shù)分別為0.6%、0.8%和1.0%時，碳源提取率分別達到了72.1%、75.3%和75.9%，均明顯優(yōu)于單一淀粉酶的作用效果。進一步考察了復(fù)合酶質(zhì)量比(α/γ)對餐廚固渣碳源水解的影響。結(jié)果顯示，碳源提取率隨著α/γ添加質(zhì)量比的增加呈先升后降的趨勢；當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量比為3∶1時，碳源提取率達到最高值(圖2-b)。由此可見，復(fù)合淀粉酶的協(xié)同作用可以更為有效地回收餐廚固渣中的碳源。這是因為當(dāng)α-淀粉酶與γ-淀粉酶共同作用時，α-淀粉酶可將淀粉水解成糊精和低聚糖等產(chǎn)物，從而為γ-淀粉酶提供了更多的非還原性末端；而γ-淀粉酶能夠?qū)⒑偷途厶沁M一步水解，理論上有助于α-淀粉酶的催化反應(yīng)[11]。此外，在一定范圍內(nèi)，酶添加質(zhì)量分數(shù)(0.6%、0.8%、1.0%)和添加質(zhì)量比(2∶1、3∶1、4∶1)對復(fù)合酶的作用效果影響并不顯著(P>0.05)。從成本等方面綜合考慮，最佳酶添加質(zhì)量分數(shù)和復(fù)合酶質(zhì)量比分別確定為0.6%和3∶1。由此可見，相較于單一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶協(xié)同處理不僅可以提高碳源提取效果，而且酶使用量更少。

2.2.2 酶解溫度對復(fù)合酶作用效果的影響

溫度是影響酶催化活性的關(guān)鍵因素之一[12]。針對2種淀粉酶反應(yīng)條件的差異，進一步分析了酶解溫度對復(fù)合淀粉酶作用效果的影響。如圖3所示，餐廚固渣碳源提取率隨著酶解溫度的上升呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度從40 ℃升高至60 ℃，碳源提取率從65.0%逐步增加至73.9%；但是進一步提高反應(yīng)溫度會破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低，碳源提取率顯著下降至50.4%(80 ℃)。實驗結(jié)果表明，溫度對碳源提取率的影響極顯著(P<0.01)，因此進一步選擇50、60、70 ℃ 3個水平進行響應(yīng)面分析。

2.2.3 pH值對復(fù)合酶作用效果的影響

在酶促反應(yīng)過程中，pH變化不僅影響底物的解離狀態(tài)，而且會改變酶分子活性位點的必需基團解離形態(tài)和空間構(gòu)象，進而影響酶活性[13]，且不同的酶對pH變化的響應(yīng)各不相同。因此本研究考察了不同pH條件下復(fù)合淀粉酶的協(xié)同作用效果。如圖4所示，當(dāng)pH值為3～6時，餐廚固渣碳源提取率從44.0%顯著提高至73.2%；繼續(xù)提高pH會導(dǎo)致酶解效果下降，碳源提取率在pH 8.0的條件下顯著降低至52.6%。實驗結(jié)果分析表明復(fù)合淀粉酶的作用效能受pH影響較為顯著(P<0.01)，因此進一步選擇pH 5.0、6.0和7.0三個水平進行響應(yīng)面分析。

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對復(fù)合酶作用效果的影響

底物質(zhì)量濃度對復(fù)合淀粉酶作用效果的影響如圖5所示。餐廚固渣碳源提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為200 g/L時，復(fù)合酶解效果最好，餐廚固渣碳源提取率達到73.6%。適當(dāng)?shù)牡孜餄舛饶軌蛟诒ＷC酶分子與反應(yīng)底物充分接觸的同時，促進更多的底物轉(zhuǎn)化，因此有助于提高酶催化效率[14]。但是過高的底物濃度會造成有效濃度下降，反應(yīng)體系黏度的增大會抑制各組分的擴散，酶分子和底物無法充分結(jié)合，導(dǎo)致酶解效率降低。此外，高濃度底物還可能與酶分子形成無活性的中間復(fù)合物，從而抑制酶促反應(yīng)[15]。實驗結(jié)果分析表明，底物質(zhì)量濃度對餐廚固渣碳源提取效果影響極顯著(P<0.01)，因此進一步選擇底物質(zhì)量濃度150、200、250 g/L 3個水平進行響應(yīng)面分析。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 模型的建立與顯著性分析

單因素實驗結(jié)果表明，酶解pH(A)、底物質(zhì)量濃度(B)和溫度(C)對復(fù)合淀粉酶作用效果的影響極為顯著(P<0.01)。因此，本研究以此3個因素為自變量，以碳源提取率為響應(yīng)值(E)，進一步采用Box-Behnken響應(yīng)面法對餐廚固渣碳源提取工藝條件展開優(yōu)化。響應(yīng)面分析結(jié)果如表3所示，1～12號是析因?qū)嶒灒?3～17號是中心實驗。17個實驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量，零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)5次。通過數(shù)據(jù)擬合建立二次回歸模型：

E=74.66+1.82A-3.55B-1.93C+0.9AB-0.78AC+1.72BC-6.28A2-12.58B2-3.81C2。

表3 優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and result of response surface experiment

表4 回歸模型方差分析Table 4 The variance analysis of regression model

2.3.2 最佳酶解條件的預(yù)測及實驗驗證

通過對二次多項數(shù)學(xué)模型進行解析，3個顯著性影響因素的最佳條件為：酶解溫度56.96 ℃、pH 6.15、底物質(zhì)量濃度192.2 g/L，理論碳源提取率預(yù)測值為75.4%。進一步通過實驗對模擬結(jié)果進行驗證，實驗條件設(shè)置為：酶解溫度57.0 ℃、pH 6.2、底物質(zhì)量濃度190 g/L，酶添加質(zhì)量分數(shù)0.6%以及復(fù)合酶質(zhì)量比3∶1。通過4次驗證實驗，最終獲得的餐廚固渣碳源提取率為(76.9±3.1)%，與理論預(yù)測值誤差僅為1.5%，確認了該模型的有效性。

2.4 等電點沉淀法提高碳源純度

餐廚固渣復(fù)合酶解提取碳源過程中會有一些蛋白質(zhì)隨之溶出，影響碳源純度。等電點沉淀法是利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的特性，通過調(diào)節(jié)液相pH使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法[17]。施正華等[18]通過等電點沉淀法回收污泥水解液中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)回收率可達到87.5%，展現(xiàn)出較好的沉淀效果。因此本研究進一步考察了等電點沉淀法對餐廚固渣復(fù)合淀粉酶水解液中蛋白質(zhì)的去除效果。初始水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為13.6 g/L。通過動態(tài)調(diào)節(jié)pH可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)濃度在pH 3.0～5.0呈現(xiàn)出U型曲線(圖6)。當(dāng)pH值為3.75時，水解液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下降至9.4 g/L，蛋白質(zhì)去除率達到30.9%。結(jié)果表明，借助蛋白質(zhì)等電點沉淀法可以進一步提高水解液中的碳源純度。

表5 等電點處理前后提取液有機質(zhì)濃度變化Table 5 Changes of organic matter concentration in the extracting solution by isoelectric precipitation

3 結(jié)論

采用淀粉酶水解結(jié)合等電點沉淀法可以較好地回收餐廚固渣中的有機碳源。研究結(jié)果證明，相較于單一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶的協(xié)同作用能夠在較少的酶使用量下顯著提高碳源提取效率。通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳酶解條件：酶解溫度57.0 ℃、pH 6.2、底物質(zhì)量濃度190 g/L，酶添加質(zhì)量分數(shù)0.6%以及復(fù)合酶質(zhì)量比3∶1，碳源提取率達到76.9%。等電點沉淀法能夠進一步提高回收碳源純度，回收液中BOD質(zhì)量濃度和BOD/N分別達到了76.8 g/L和51.2，完全有潛力作為污水處理的外加碳源使用。研究結(jié)果可為我國餐廚垃圾的精細化、資源化利用提供有益思路。