李石巖，李燕波，曹 雷，郝旭峰，何志良，張 晗，王承陽，高 玥，蘇丹妮

(河北省承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000)

骨具有固有的再生能力，但在許多情況下，仍需要改善骨修復(fù)能力的策略。骨再生取決于骨缺損類型。例如，大約10%的骨缺損是不愈合的，不能自發(fā)愈合，導(dǎo)致骨組織再生不當和延遲愈合。因此，為了提高骨再生能力，避免上述局限性，人們進行了許多嘗試，以開發(fā)出合適的由天然或合成生物材料組成的骨結(jié)構(gòu)。一些聚合物由于其生物相容性、可生物降解性、可調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)特性和易于制造，因此通常是很好的候選材料?？山到饩酆衔飳τ谶@些類型的修復(fù)非常重要，以避免阻礙骨的完全再生，可降解聚合物分為天然聚合物，如海藻酸鹽、殼聚糖、膠原蛋白、絲和合成聚合物，包括聚二氧六環(huán)酮(polydioxanone，PDS)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)，和聚乳酸-羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)。近年來，由于其獨特的生物相容性、多功能性和生物降解性，天然聚合物在骨組織工程中的應(yīng)用越來越受到重視。這些類型的聚合物提供了由配體組成的圖案良好的結(jié)構(gòu)，這些配體可以與細胞表面受體結(jié)合或提供可進入的酶降解位點[2]。

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種天然纖維聚合物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。SF因其具有彈性、柔韌性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)異特性，在骨組織工程領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。近年來，各種各樣的研究也集中在天然聚合物和SF在骨修復(fù)中的應(yīng)用。雖然其中一些聚合物具有骨再生的內(nèi)在能力，但這不足以修復(fù)大面積骨缺損。因此，在聚合物基質(zhì)中加入顆粒有助于改善支架的力學(xué)性能和調(diào)整支架的地形特征，從而模擬自然骨的結(jié)構(gòu)[3]。

然而，SF必須進行功能化后方可發(fā)揮上述作用，否則低成骨能力限制了SF在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是一種成熟的生物陶瓷，具有與骨組織相似的性質(zhì)和良好的生物相容性，是一種可與不同聚合物相結(jié)合的生物陶瓷相[4]。然而，HA陶瓷易脆化，限制了其在骨修復(fù)中的應(yīng)用[5]。幾種天然聚合物，包括膠原蛋白、明膠、殼聚糖和蠶絲，已與HA結(jié)合使用，以促進骨再生[6]。因此，將SF和HA共混，結(jié)合了這兩種材料作為組織工程骨結(jié)構(gòu)的優(yōu)異特性，基于SF/HA復(fù)合材料用于骨組織再生值得深入探討。

急慢性炎癥在骨修復(fù)過程中起著不可缺的作用。炎癥細胞(多形核白細胞和單核-巨噬細胞-破骨細胞系細胞)和與骨愈合相關(guān)的細胞(間充質(zhì)干細胞-成骨細胞系和血管系細胞)之間的串擾對骨的形成、修復(fù)和重塑至關(guān)重要[7]。炎性小體(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)是一種細胞內(nèi)機制，激活的NLRP3可分泌IL-1β和IL-18，繼而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究表明，抑制NLRP3炎性小體促進糖尿病大鼠牙槽骨缺損愈合[8]。但在SF/HA復(fù)合材料應(yīng)用過程中對NLRP3的作用尚不明確。

本研究旨在探討絲蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料修復(fù)兔骨缺損過程中對IL-1β和IL-18的基因表達，及NF-κB和NLRP3的蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；離心機(Medifuge公司，意大利)；倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)；HA購自(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)；一抗(p-NF-κB p65,NF-κB p65,NLRP3,β-actin)購自Abcam公司；細胞總RNA提取試劑盒、一步法實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2組織工程骨的制備:購買的桑蠶繭被用來產(chǎn)生絲綢溶液，桑蠶蠶繭在0.2 M Na2CO3中切割脫膠30min，然后在37℃干燥24h，將脫膠纖維溶解在9.3M溴化鋰溶液中，在60℃孵育4h，用12 kDa的膜用去離子水透析蛋白質(zhì)溶液72h，測定絲素濃度為3%(w/v)，在1×磷酸鹽緩沖液(PBS)中制備了3%w/v的鋁鈉溶液，將測定量的HA超聲分散在1×PBS的中孵育30min，制備的絲素和HA分散液的最終濃度分別為1%w/v和30%w/w。通過微尖噴嘴將制備的溶液逐滴(5mL/min)添加到0.2 M CaCl2溶液中，尖端在0.2 M CaCl2溶液上方3cm處，將復(fù)合材料老化12h以完成離子交換，并在37℃下干燥。

1.3動物模型和實驗分組:選擇新西蘭白兔16只(6周齡，雄性)，體重為2.0～2.2kg。全身麻醉，采用隨機數(shù)字法分為兩組，每組8只，分別為手術(shù)+HA組和手術(shù)+SF/HA組。手術(shù)方式為常規(guī)消毒兔右面頸部，沿右下頜骨下緣作弧形切口，逐層分離、暴露右側(cè)下頜骨，并于右側(cè)下頜骨中部截骨，同時去除右側(cè)下頜骨和骨膜，制造15mm長的右側(cè)下頜骨節(jié)段性骨缺損模型。兩組同時行右下頜骨下緣作弧行切口至去除右側(cè)下頜骨和骨膜，分別給予HA培養(yǎng)制備的組織工程骨和SF表面修飾的HA培養(yǎng)制備的組織工程骨。術(shù)后保溫至清醒，進行常規(guī)飼養(yǎng)48h。

1.4實時定量RT-PCR:術(shù)后48h取術(shù)區(qū)邊緣1cm處的骨組織，用TRIzol試劑(Invitrogen)從骨組織中分離總RNA，測定RNA的濃度和純度，測量了260nm處的吸光率和260/280nm的吸光率(Eppendorf，德國)。然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物進行PCR擴增，計算各組骨組織中RNA的相對表達量。見表1。

表1 實驗中所用到的引物

1.5免疫印跡法:用RIPA裂解液和PMSF溶解骨組織。用SDS-PAGE法從各組骨組織中分離出50～60μg總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉細胞膜，然后用抗p-NF-κB p65(1∶500；Abcam)、NF-κB p65(1∶1000；Abcam)、NLRP3(1∶500；Abcam)、β-actin(1∶1000；Abcam)的一抗孵育。用TBST洗滌后，用辣根過氧化物酶結(jié)合二抗(1∶5000)孵育膜，并用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ChampChemi；SAGECREATION，北京)觀察免疫印跡并拍照，灰度值圖像J(NIH，Bethesda，MD)統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1SF/HA對骨修復(fù)狀態(tài)下IL-1β和IL-18基因水平的影響:與手術(shù)+HA組相比，手術(shù)+SF/HA組IL-1β的mRNA水平明顯從4.56±0.26降低至2.09±0.12(P<0.05)；IL-18的mRNA水平明顯從5.08±0.08降低至2.20±0.21(P<0.05)(圖1)。

圖1 SF/HA對骨修復(fù)狀態(tài)下骨組織中IL-1β和IL-18基因水平的影響

2.2SF/HA對骨修復(fù)狀態(tài)下NF-κB和NLRP3蛋白水平的影響:與手術(shù)+HA組相比，手術(shù)+SF/HA組p-NF-κB的蛋白水平明顯從1.24±0.15降低至0.62±0.03(P<0.05)；NLRP3的蛋白水平明顯從1.15±0.04降低至0.61±0.05(P<0.05)(圖2)。

圖2 SF/HA對骨修復(fù)狀態(tài)下兔骨組織中NF-κB和NLRP3蛋白水平的影響

3 討 論

骨組織工程為修復(fù)骨缺損提供了合適的結(jié)構(gòu)[9]。通過工程生物材料模擬自然組織的結(jié)構(gòu)和組成，如開發(fā)無機-有機復(fù)合材料，在過去的幾十年里引起了人們的興趣和關(guān)注。生物活性玻璃、HA、檸檬酸鈣等典型陶瓷材料是骨組織工程的理想候選材料[10,11]。

SF與HA的共混促進了HA沿c軸方向的結(jié)晶，并對SF和HA的結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生了協(xié)同作用。HA的成核可以提高SF的分子取向和結(jié)晶度。同時，在SF中添加HA可以改善SF的生物學(xué)性能和力學(xué)性能，HA/SF復(fù)合材料與模擬自然骨組織無機和有機相的天然骨結(jié)構(gòu)。因此，將無機和有機材料結(jié)合在一種獨特的混雜復(fù)合材料中可以提高骨組織支架的柔韌性、機械強度和韌性。

骨損傷引起急性炎癥反應(yīng)，有益于骨修復(fù)，然而，如果急性炎癥反應(yīng)被抑制、失調(diào)，或演變?yōu)槁匝装Y，可延緩或抑制骨損傷修復(fù)。關(guān)于SF與HA的共混對骨修復(fù)過程中慢性炎癥反應(yīng)的作用，本研究結(jié)果表明，與應(yīng)用HA培養(yǎng)制備的組織工程骨組比較，SF表面修飾的HA培養(yǎng)制備的組織工程骨明顯降低IL-1β和IL-18的mRNA水平，以及NF-κB和NLRP3的蛋白表達水平，本研究結(jié)果與藻酸鹽/HA/SF復(fù)合材料作為骨替代物的研究結(jié)果一致，植入藻酸鹽/HA/SF 4周后，與海藻酸鈉組相比較，海藻酸鈉/HA/SF支架組缺損部位的骨形成率明顯升高，同時海藻酸鈉/HA/SF支架具有良好的生物相容性，降解后的移植物周圍免疫原性反應(yīng)減弱或形成巨細胞，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在海藻酸鈉/HA/SF組的表達水平明顯低于海藻酸鈉和海藻酸鈉/HA組。本研究證明了絲蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料通過可能通過抑制炎癥反應(yīng)促進骨損傷修復(fù)，其機制可能是通過抑制NF-κB/NLRP3通路的激活，繼而減緩該通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具體機制待進一步研究，下一步的研究可著眼于絲蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料對骨損傷修復(fù)過程中焦亡、自噬、氧化應(yīng)激等方面的影響，該研究結(jié)論提升了絲蛋白-羥基磷灰石復(fù)合材料在骨損傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用價值。