馬思佳 趙明明 常美瑩 余 怡 王如夢 張 昱

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腎病科，北京 100091

IgA 腎病是世界范圍內(nèi)最常見的腎小球腎炎，以系膜區(qū)沉積免疫球蛋白A（IgA）為主要特點[1]。該病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，現(xiàn)階段仍不十分明確，因此找出最佳治療方法是一個重大挑戰(zhàn)。目前，IgA 腎病仍然是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[2-4]。既往臨床上治療IgA 腎病多會應(yīng)用免疫抑制療法，但近來有研究發(fā)現(xiàn)，對于正在進行綜合支持治療的，以中度蛋白尿和慢性腎臟疾病1～3 期為特征的IgA 腎病患者，采用增加免疫抑制的療法并沒有益處[1]。大量使用免疫抑制劑及激素雖在一定程度上可改善患者的癥狀，但均不足以阻斷或逆轉(zhuǎn)其病理發(fā)展，且存在容易產(chǎn)生耐藥性，出現(xiàn)股骨頭壞死、痤瘡、脫發(fā)等副作用，加重患者不適感等弊端。而中醫(yī)藥在長期的臨床實踐基礎(chǔ)上積累了不少治療經(jīng)驗，經(jīng)過研究證實，可有效改善患者癥狀，延緩腎臟病進展[5]。具有副作用小、易于接受的優(yōu)勢。因此，臨床上許多患者經(jīng)西藥治療后效果欠佳，多采用中藥復(fù)方進行輔助治療，以增強效果。

加味黃芪赤風(fēng)湯是中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院（以下簡稱“我院”）腎病科張昱教授及其團隊，通過長期的臨床運用，對中醫(yī)藥防治IgA 腎病進行觀察、總結(jié)及研究所取得的成果，是基于該病“虛-風(fēng)-瘀-毒”的病機，在清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯》所載黃芪赤風(fēng)湯的基礎(chǔ)上加味而成，主要由生黃芪、赤芍、防風(fēng)、金櫻子、芡實、穿山龍、白花蛇舌草等組成[6]。臨床應(yīng)用本方治療IgA 腎病?？墒斋@滿意效果[7]，本課題組前期采用真實世界研究的方法，收集2015 年1 月—2016 年12 月于我院門診就診的IgA 腎病并符合氣虛血瘀癥的患者295 例，以加味黃芪赤風(fēng)湯治療24 周后患者24 h蛋白尿水平及中醫(yī)癥狀積分較治療前下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），總有效率達77%[7]。

中藥具有多成分、多靶點的作用特點，因此在研究中藥及其復(fù)方治療某些疾病的作用機制時，難度會大大增加，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)則在一定程度上為中藥作用機制的細化研究提供了幫助。為深入挖掘加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的潛在生物學(xué)機制，本研究通過篩選加味黃芪赤風(fēng)湯的活性成分，預(yù)測活性成分的生物靶點，構(gòu)建活性成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)和IgA 腎病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)等，從整體性觀察加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的潛在生物學(xué)機制，探討其潛在的作用機制，分析其復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分收集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）將加味黃芪赤風(fēng)湯中的主要組成藥物分別輸入TCMSP 進行成分檢索，以口服生物利用度（OB）值≥30%、藥物相似性（DL）值≥0.18 作為篩選條件，篩選出該方的活性成分。

1.2 加味黃芪赤風(fēng)湯潛在作用靶點的預(yù)測

利用TCMSP 獲取篩選出的加味黃芪赤風(fēng)湯的每個活性成分對應(yīng)的潛在靶點信息，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫除去沒有相應(yīng)靶點的成分，然后應(yīng)用Perl 軟件（V5.24.1）為篩選出的靶點添加基因名及規(guī)范靶點的基因名。

1.3 IgA 腎病相關(guān)靶點的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）中以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵詞檢索，得到有關(guān)IgA 腎病的相關(guān)靶點信息。

1.4 中藥-IgA 腎病靶點的構(gòu)建

利用R 語言（V3.6.2）計算出加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分靶點和IgA 腎病交集的靶點，從而得到中藥復(fù)方-IgA 腎病的共同靶點，將映射結(jié)果以韋恩圖的形式繪制出來。

1.5 加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用Perl 軟件將“1.1”項下獲得的加味黃芪赤風(fēng)湯中的活性成分和“1.4”項下獲得的中藥復(fù)方-IgA 腎病靶點進行一一映射，借助Cytoscape 軟件（V3.7.0）進行繪圖，構(gòu)建出加味黃芪赤風(fēng)湯各中藥-有效成分網(wǎng)絡(luò)圖及加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。之后利用該軟件的分析功能以Degree 值作為拓撲分析的主要參考依據(jù)，篩選排名靠前的靶點作為核心靶標，從而繪制出核心靶點的柱狀圖。

1.6 構(gòu)建中藥-IgA 腎病靶點蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的中藥-IgA 腎病靶點蛋白以文本形式上傳至String 在線軟件，篩選條件種屬選擇為人類，進行PPI 網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，保存相應(yīng)結(jié)果文本文件及圖形。

1.7 GO 功能和KEGG 通路富集分析

借助R 語言軟件對得到的中藥-IgA 腎病靶點進行相應(yīng)計算，得到相關(guān)的GO 功能和KEGG 通路富集分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，繪制相應(yīng)的柱狀圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 加味黃芪赤風(fēng)湯有效成分篩選匯總

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中根據(jù)OB、DL 值篩選后共得到了85個關(guān)于加味黃芪赤風(fēng)湯的有效化學(xué)成分，其中7個來自白花蛇舌草，3個來自穿山龍，28個來自赤芍，18個來自防風(fēng)，20個來自黃芪，7個來自金櫻子，2個來自芡實，排除重復(fù)部分，共45個活性成分。

2.2 中藥-IgA 腎病靶點構(gòu)建的結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取到1252個潛在作用靶點，在OMIM 中獲取到31個潛在作用靶點，將兩者匯總后，利用R 語言軟件將疾病相關(guān)靶點與加味黃芪赤風(fēng)湯有效活性成分靶點取交集，繪制出中藥-IgA腎病共同靶點的韋恩圖，其中95個為疾病與中藥復(fù)方重合作用的靶點，IgA 腎病相關(guān)靶點為1283個，加味黃芪赤風(fēng)湯有效作用靶點為228個。見圖1。

圖1 加味黃芪赤風(fēng)湯與IgA 腎病相關(guān)的韋恩圖

2.3 加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過收集加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分的靶點和IgA腎病的相關(guān)靶點，在Cytoscape 中構(gòu)建出該方成分-疾病-靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2 所示，倒三角形代表中藥名稱，長方形代表加味黃芪赤風(fēng)湯中各中藥具有的有效成分，成分和靶點之間的相互作用以邊表示。加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖如圖3 所示，該網(wǎng)絡(luò)圖中共有141個節(jié)點與366 條邊，倒三角形節(jié)點代表加味黃芪赤風(fēng)湯中有效成分，圓形節(jié)點代表IgA腎病與該復(fù)方共同作用的靶點。由圖3 可知，存在一個成分與多個靶點相交或多個成分與一個靶點相交的現(xiàn)象，證實了加味黃芪赤風(fēng)湯是在多成分、多靶點的基礎(chǔ)上輔助治療IgA 腎病的。選取Cytoscape 中的Network-Analyzer 選項，對節(jié)點的Degree 值及相關(guān)參數(shù)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，找到了節(jié)點Degree 值排名前10 位的基因作為核心靶標，其中包括白蛋白（ALB），白細胞介素-6（IL-6），絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1），血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）等，以數(shù)字代表節(jié)點Degree 值，這些靶點可作為加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA腎病的潛在靶點以進行進一步研究。見圖4。

圖2 加味黃芪赤風(fēng)湯各中藥-有效成分網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 加味黃芪赤風(fēng)湯活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排名前10 的活性成分

2.4 交集基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在String 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入加味黃芪赤風(fēng)湯與IgA腎病的交集靶點，得到中藥-IgA 腎病交集靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中，節(jié)點表示蛋白，連線表示蛋白之間存在聯(lián)系。見圖5。

圖5 加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 功能富集分析

加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病核心靶標的GO功能富集分析的柱狀圖見圖6（封四）。該復(fù)方治療IgA 腎病可能主要是通過細胞因子受體結(jié)合、抗氧化、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等過程實現(xiàn)的。

圖6 加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA腎病的GO富集分析

2.6 KEGG 功能富集分析

加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的核心靶標KEGG 通路富集分析的氣泡圖見圖7（封四）。該復(fù)方主要是通過干預(yù)AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路和人類巨細胞感染通路、HIF-1 信號通路等治療IgA 腎病的。

圖7 加味黃芪赤風(fēng)湯治療lgA腎病的KEGG通路富集分析

3 討論

IgA 腎病最早由Berger 和Hinglais 于1968 年提出，是一種被定義為以IgA 在腎小球內(nèi)沉積占主導(dǎo)地位的腎小球腎炎[9]。臨床發(fā)病以20～30 歲多見，亞洲發(fā)病率高于全球其他地區(qū)[10]。大量的IgA 與補體在腎內(nèi)沉積，會引起腎小球系膜細胞增生、腎小球節(jié)段硬化或粘連、毛細血管內(nèi)細胞增多、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化等，從而進一步損傷腎臟功能[11]。越來越多的研究表明，大部分的IgA 患者最終會進展為腎衰竭。由于IgA 腎病的具體發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前仍不明確，因此，如何降低蛋白尿，減輕腎臟負擔，改善病理損傷，延緩病情發(fā)展成為治療該疾病的首要任務(wù)和相關(guān)領(lǐng)域的研究熱門。

由于中藥復(fù)方成分、靶點、機制復(fù)雜的客觀難題，使得傳統(tǒng)藥理學(xué)方法很難從整體性的角度觀察和探討加味黃芪赤風(fēng)湯的潛在生物學(xué)機制，尤其是相互關(guān)聯(lián)的生物分子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[8]。通過某個特定靶點往往不能有效地干預(yù)或控制IgA 腎病的進程，而中藥復(fù)方的組合形式往往多種多樣，每一味藥物中含有的有效活性成分不同，具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，在治療IgA 腎病這類由多種病理機制共同影響的疾病時，往往是重要的干預(yù)措施。黃芪赤風(fēng)湯首載于清代王清任的《醫(yī)林改錯》，方中包含生黃芪、赤芍、防風(fēng)三味藥，具有益氣通陽、活血行滯、祛風(fēng)通絡(luò)的功效。張昱教授精研其方，認為該方與慢性腎病本虛標實，虛-風(fēng)-瘀-毒的病因病機特點不謀而合，諸藥配伍共奏健脾補腎、益氣活血、祛風(fēng)解毒之功，虛實兼顧，標本同調(diào)[12-13]。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)平臺，應(yīng)用生物信息學(xué)對加味黃芪赤風(fēng)湯進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，探究加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的作用機制。本研究共篩選出主要包括槲皮素、β-谷甾醇、黃芩苷元、山柰酚等在內(nèi)的45個有效活性成分，其可能通過影響ALB、IL-6、AKT1、VEGFA等潛在靶點，發(fā)揮治療IgA 腎病的關(guān)鍵作用。后續(xù)通過IgA 腎病相關(guān)靶點的PPI 預(yù)測和GO 生物功能及KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)該方可能主要通過AGE-RAGE 信號通路、前列腺癌通路、乙型肝炎通路、IL-17 信號通路等，干預(yù)磷酸酶結(jié)合、血紅素結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、細胞抗氧化、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物過程，從而發(fā)揮其保護腎臟功能，改善病理損傷等作用來治療IgA 腎病。

前期已有大量的臨床研究證實了加味黃芪赤風(fēng)湯中的各類中藥有效成分可有效延緩IgA 腎病患者腎功能惡化，保護患者腎功能[14-16]。而加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果也與之前眾多實驗的研究結(jié)果相契合。葉苗等[17]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用槲皮素可使血清炎癥因子顯著降低，其可能通過抑制炎癥反應(yīng)和緩解細胞凋亡起到保護腎臟，使其免受缺血再灌注損傷的作用。黃芩苷可有效改善糖尿病大鼠的腎功能，降低細胞外基質(zhì)（ECM）沉積，修復(fù)損傷的腎小球足細胞并減輕局部的炎癥反應(yīng)[18]，山奈酚[19]可有效抑制高糖引起的大鼠腎系膜細胞p38MAPK 蛋白的磷酸化，減少腎細胞膜細胞增殖。毛蕊異黃酮可保護腎小球，增加腎臟血液灌注量，改善腎臟血流動力，具有抗腎臟組織纖維化的作用[20]。有相關(guān)研究表明[21-23]，在伴有營養(yǎng)不良和炎癥的終末期腎病患者中，炎癥的發(fā)生可能于激活A(yù)GE-RAGE 信號通路后，導(dǎo)致血清可溶性黏附分子水平升高有關(guān)。此外，VEGF 在新生血管生成和血管高通透性中也起著重要作用，其不但會使局部新生血管內(nèi)皮增生，還參與局部氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，破壞腎小管上皮細胞的完整性，使腎小管上皮細胞的重吸收功能受損，導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的電解質(zhì)紊亂[24-26]。IL-17 是具有較強促炎作用的物質(zhì)，可以誘導(dǎo)其他細胞因子，促進炎癥細胞募集，促進T 細胞浸潤，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，加重腎組織損傷。有研究表明IL-17 參與了IgA 腎病的發(fā)病過程[27]，患者腎小管間質(zhì)及外周血中IL-17 表達增高，并與臨床及病理預(yù)后指標密切相關(guān)，提示IL-17 可能是參與IgA 腎病發(fā)病及進展的因素之一。芍藥苷可以作用于TNF 信號通路，有抑制炎癥反應(yīng)及抵抗細胞壞死和纖維化的作用[28]，且其還具有降低IL-17 在人體內(nèi)表達的作用[29]。人巨細胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒感染在IgA 腎病的發(fā)生與發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的作用。馮曉麗[30]發(fā)現(xiàn)人巨細胞病毒多表達于腎小球及腎小管；腎小管、腎小球間質(zhì)破壞程度與人巨細胞病毒抗原表達水平變化呈正相關(guān)；乙型肝炎病毒在腎小管上皮細胞內(nèi)的表達水平較高，也有微量表達于腎間質(zhì)、腎小球內(nèi)。人巨細胞病毒感染會下調(diào)內(nèi)皮細胞和細胞滋養(yǎng)層的金屬蛋白酶-9（MMP-9）活性，特異性地降低MMP-9 的表達和活性[31]。在IgA 腎病中，MMP-9在系膜增殖性腎小球和間質(zhì)血管壁的表達均明顯增多，導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)過度重塑，使ECM 過度聚積，形成蛋白尿，加重腎臟組織損傷，這可能是影響IgA 腎病進展的因素之一[32]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步研究了加味黃芪赤風(fēng)湯治療IgA 腎病的作用機制，主要是發(fā)揮其多成分、多靶點、多通路的方式，協(xié)同作用，保護腎臟功能，延緩病理損傷。為后續(xù)進一步研究加味黃芪赤風(fēng)湯輔助治療IgA 腎病的作用機制奠定了研究基礎(chǔ)，為臨床上合理應(yīng)用加味黃芪赤風(fēng)湯提供了理論支持，具有重大意義。但是其具體的有效成分與詳細的作用機制還有待于更深入、更細化的挖掘與討論，并需要進行相關(guān)實驗佐證。