薛艷君 吳嬌娟 張旭東 蔚鵬程 吳小麗 劉清國

北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029

高血壓是一種以原因不明的體循環(huán)動脈壓升高為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，其患病率在全球范圍內(nèi)呈增長趨勢[1]，可造成嚴(yán)重的心、腦、腎等靶器官損害[2-3]。目前西醫(yī)主要以口服降壓藥來控制血壓，但長期服藥副作用大，而針刺療法相對簡便、安全。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，針刺太沖穴可通過調(diào)控內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方式保護(hù)心、腦、腎等靶器官，實(shí)現(xiàn)降壓目的。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法作為傳統(tǒng)針刺手法之一，施以合適的手法操作可以提高針刺療效[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法作用于太沖穴可起到降壓效果且對腦區(qū)的生化指標(biāo)有影響，且與捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法比較，捻轉(zhuǎn)瀉法的降壓效果較好[7-12]。但目前關(guān)于針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法降壓的研究較少，其機(jī)制尚不清楚，需要深入挖掘。相關(guān)研究表明，高血壓狀態(tài)下，腦部氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，導(dǎo)致與控制認(rèn)知功能相關(guān)的海馬發(fā)生神經(jīng)退行性病變[13]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）為衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物，有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以通過調(diào)節(jié)其含量來提高機(jī)體的抗氧化能力，實(shí)現(xiàn)降壓目的[14-15]。因此，本研究以自發(fā)性高血壓大鼠為模型，通過觀察不同針刺手法下其海馬的組織形態(tài)及海馬中MDA、GSH-Px 含量的變化，探討針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法對高血壓海馬損傷的相關(guān)防護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF 級9 周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠18 只（實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：11400700317072），Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6 只（實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：114007 00312513），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2006-0006，平均（220±15）g。所有大鼠在北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)（動物保護(hù)與倫理批準(zhǔn)號：BUCM-4-2018061501-2058）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將自發(fā)性高血壓大鼠分為瀉法組、補(bǔ)法組、模型組，每組6 只，另取6 只WKY 大鼠作為空白組。

1.2 主要儀器和試劑

漢醫(yī)牌針灸針（規(guī)格：0.18 mm×13 mm，北京漢醫(yī)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司）；ACX-XM 計(jì)重電子秤（精密度：0.01 mg，上海升亮電子科技有限公司）；Leica UC7 超薄切片機(jī)（德國徠卡公司）；顯微鏡（自動化智能型正置研究級顯微鏡，BX53，日本奧林巴斯）；高速冷凍離心機(jī)（20PR-52D，日本日立）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津泰斯特儀器有限公司）。主要試劑盒：MDA 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A003-1）；GSH-Px 試劑盒（南京建成生物工程研究所，A005-50）。

1.3 方法

太沖穴取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[16]教材大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位，于后肢足背1、2 跖骨凹陷處取太沖穴。針刺方法如下，①瀉法組：右手為刺手，直刺雙側(cè)太沖穴1～2 mm，行捻轉(zhuǎn)瀉法（先左側(cè)后右側(cè)），拇指向后時(shí)用力重，向前退回力輕，幅度360°，60 次/min，持續(xù)3 min，留針20 min，治療14 d。②補(bǔ)法組：右手為刺手，直刺雙側(cè)太沖穴1～2 mm，行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法（先左側(cè)后右側(cè)），拇指向前時(shí)用力重，向后退回力輕，幅度360°，60 次/min，持續(xù)3 min，留針20 min，治療14 d。針刺時(shí)間集中在每天下午2:00—4:00 之間，所有操作由同一人完成。③模型組和空白組每日在相同時(shí)間進(jìn)行相同穴位的抓取固定刺激。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 HE 染色觀察海馬形態(tài)學(xué)變化 干預(yù)結(jié)束后第15 天，大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后迅速固定，斷頭取腦，剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，取下海馬，移入4%多聚甲醛固定24 h。經(jīng)脫水、透明、浸蠟后常規(guī)包埋，用切片機(jī)切成4 μm 薄片，烘烤后將切片依次置于二甲苯、無水乙醇、酒精、蒸餾水中脫蠟，用蘇木精染色細(xì)胞核6 min，水洗后用0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗，伊紅染色細(xì)胞質(zhì)3 min，脫水后用二甲苯透明樹膠封片，最后將切片置于顯微鏡下（400×）觀察。

1.4.2 海馬區(qū)MDA、GSH-Px 含量測定 干預(yù)結(jié)束后第15 天，大鼠稱重后用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后迅速固定，斷頭取腦，于冰臺上剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦組織，取下海馬，經(jīng)生理鹽水漂洗后裝于標(biāo)記好的EP 管，迅速投入液氮中備用。將海馬組織和生理鹽水按1∶9 的比例制備10%組織勻漿，后取勻漿于離心機(jī)3000 r/min（離心半徑13.5 cm）離心20 min，取上層清液，嚴(yán)格按照MDA、GSH-Px 試劑盒的要求步驟操作，測定其在海馬中的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬齒狀回區(qū)HE 染色結(jié)果

空白組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間隙正常，多數(shù)細(xì)胞核深染，核仁清晰，未見變性壞死；與空白組比較，模型組染色明顯變淺，出現(xiàn)核固縮、細(xì)胞溶解碎裂、空泡樣變性和凋亡細(xì)胞。與模型組比較，瀉法組和補(bǔ)法組均可見細(xì)胞輪廓較清晰，細(xì)胞染色加深，核仁清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。見圖1。

圖1 各組海馬齒狀回區(qū)HE 染色（400×）（n=6）

2.2 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較

模型組MDA 含量高于空白組，GSH-Px 含量低于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。補(bǔ)法組、瀉法組MDA 含量均低于模型組，GSH-Px 含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較（）

表1 各組海馬中MDA、GSH-Px 含量比較（）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。MDA：丙二醛；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶

3 討論

高血壓是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名詞，中醫(yī)古籍中未曾有高血壓的記載，據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將其歸為中醫(yī)病證中的“頭痛”“眩暈”等范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分小爸T風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，《靈樞·口問》中“故上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴，頭為之苦傾，目為之?！?，《景岳全書》指出“眩暈一證，虛者居其八九，而兼火兼痰者，不過十中一二耳”，并強(qiáng)調(diào)“無虛不作?！?。根據(jù)歷代醫(yī)籍對高血壓相關(guān)病證的描述，高血壓可以分為虛、實(shí)兩大類。捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法起源于《內(nèi)經(jīng)》，是根據(jù)“盛則瀉之，虛則補(bǔ)之”理論確立的兩種不同治療方法。自發(fā)性高血壓是目前最成熟、應(yīng)用最多的高血壓模型，廣泛應(yīng)用于高血壓發(fā)病、靶器官損害機(jī)制的探究及降壓藥物的篩選[17]。通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠的證候特征發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠易激惹、煩躁，具有典型的肝陽上亢表現(xiàn)[18]。太沖穴既為肝經(jīng)原穴，又為肝經(jīng)腧穴，具有平肝潛陽、疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝的功效，是治療高血壓的首選穴之一[19-21]。因此本研究以自發(fā)性高血壓大鼠為模型，以針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉太沖穴為干預(yù)方式，前期研究顯示[22]，針刺捻轉(zhuǎn)瀉法作用于自發(fā)性高血壓大鼠太沖穴的降壓效果優(yōu)于捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，這與中醫(yī)傳統(tǒng)思想“實(shí)則瀉之”一致。

氧化應(yīng)激參與高血壓及其靶器官腦損害的過程，大腦的神經(jīng)細(xì)胞膜中含有豐富的不飽和脂肪酸，在高血壓影響下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量明顯增加，氧自由基作用于這些脂肪酸可以引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)過多的ROS 會通過破壞血管內(nèi)皮功能、降低壓力感受器的敏感性，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)等方式來升高血壓，導(dǎo)致惡性循環(huán)[23-25]。氧化應(yīng)激所衍生的腦損傷主要位于控制認(rèn)知功能的腦區(qū)[13]。海馬是主管認(rèn)知功能的腦區(qū)之一，研究發(fā)現(xiàn)[26-28]，在高血壓狀態(tài)下，海馬灌注和神經(jīng)樹突結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，海馬神經(jīng)突觸密度降低，最終造成認(rèn)知功能障礙。此外，有學(xué)者通過核磁共振技術(shù)觀察到，高血壓狀態(tài)下，海馬區(qū)的主要代謝成分發(fā)生異常改變[29]。

MDA 是常用的細(xì)胞膜脂過氧化指標(biāo)，氧自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，最終產(chǎn)物為MDA，其還能加劇細(xì)胞膜的損傷，通過檢測MDA 可以了解機(jī)體的抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)[30]，MDA 含量的增加與高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。針刺可以通過降低自發(fā)性高血壓大鼠腎臟組織、延髓頭腹端外側(cè)區(qū)的MDA 含量，提高機(jī)體抗氧化能力，最終實(shí)現(xiàn)降壓目的[31-32]。GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，具有特異性催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的反應(yīng)、防止自由基對細(xì)胞膜的損害、保護(hù)血管內(nèi)皮功能，降低血壓的作用[33]，其是機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)之一。有研究報(bào)道[34]，針刺可以增強(qiáng)高血壓大鼠體內(nèi)GSH-Px 的活性，改善氧化水平，使大鼠血壓得到控制。

因此，本研究以海馬為切入點(diǎn)，通過觀察海馬組織MDA、GSH-Px 的含量變化，探討針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法對高血壓海馬損害的防護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法作用于自發(fā)性高血壓大鼠雙側(cè)太沖穴，在改善海馬組織損傷的同時(shí)，可以顯著降低MDA，提升GSH-Px。提示針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法可通過調(diào)節(jié)MDA、GSH-Px 的含量，提高抗氧化能力，減緩高血壓海馬損傷程度。高血壓海馬損傷是一個受多種因素影響的復(fù)雜過程，本研究著重關(guān)注了針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法調(diào)節(jié)相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)對高血壓海馬損傷起到的作用，尚有局限性。接下來的研究可對針刺捻轉(zhuǎn)補(bǔ)瀉法調(diào)控高血壓海馬損傷的其他可能途徑做更深入的探索。