蔣 益 鄭惠華 劉廣建* 薛 璟 季宏更 張 辰 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）別名北冬蟲夏草、北蟲草，與冬蟲夏草同屬異種[1]。野生的蛹蟲草分布范圍廣，但數(shù)量稀少，十分珍貴。人工培育的蛹蟲草化學(xué)成分與野生冬蟲夏草相似，目前已被衛(wèi)健委藥食兩用名單收入。研究表明蛹蟲草蛋白含量豐富，其中必需氨基酸的種類齊全，比例適宜，同時(shí)含有多糖、核苷、甾醇等多種功效成分[2-3]。

食用菌的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為干重的20%~40%，高于大多數(shù)食品，且氨基酸組成平衡合理，比植物蛋白更全（植物性蛋白常缺少1種或2種必需氨基酸），比動(dòng)物蛋白安全（動(dòng)物蛋白常含大量脂肪和膽固醇），還含有一些稀有氨基酸。但目前對(duì)食用菌蛋白的研究仍然較少，市場上很少見到以食用菌蛋白為主原料的產(chǎn)品。蛹蟲草的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，氨基酸的種類齊全，營養(yǎng)價(jià)值高，是優(yōu)質(zhì)的新型蛋白質(zhì)資源。當(dāng)前蛹蟲草深加工產(chǎn)品主要是蟲草素、多糖、腺苷等活性成分。研究考察了凍融輔助堿提法中各因素對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響，并對(duì)所提取蛋白的氨基酸組成進(jìn)行了分析，以期為食藥用菌類蛋白質(zhì)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）供試原料：蛹蟲草子實(shí)體超微粉（300目）由江蘇省蘇微微生物研究公司提供（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.18%）。

（2）試劑：牛血清白蛋白，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、濃鹽酸、H3BO3、NaOH等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（PB-10），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；冷凍干燥機(jī)（FD-1-80），北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冷凍離心機(jī)（GL-21M），湘儀離心機(jī)儀器有限公司；凱氏定氮儀（KjeltecTM 8100），福斯分析儀器公司；紫外可見分光光度計(jì)（Alpha-1500），上海譜元儀器有限公司；氨基酸分析儀（L-8900），日本日立有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲草蛋白堿提工藝流程

蛹蟲草粉→單因素處理→9 000 r／min離心15 min→上清液調(diào)pH至等電點(diǎn)酸沉→9 000 r／min離心15 min，中和→冷凍干燥→粗蛋白提取物

1.3.2 堿提單因素試驗(yàn)

固定基礎(chǔ)提取條件：pH為11、提取溫度為30℃、料（g）液（mL）比為1∶20、提取時(shí)間為2 h。分別進(jìn)行pH、提取溫度、提取時(shí)間、料液比單因素試驗(yàn)，以確定后續(xù)試驗(yàn)的因素與水平。

1.3.3 反復(fù)凍融單因素試驗(yàn)

稱取一定量的蛹蟲草粉，按料（g）液（mL）比1∶20加水，調(diào)pH為11，分別置于-20℃低溫冰箱與-80℃超低溫冰箱中完全凍結(jié)后取出于室溫解凍，此為凍融1次，如此凍融1次、2次、3次、4次后將液體按1.3.2中的基礎(chǔ)條件提取蛋白，以不經(jīng)凍融為對(duì)照，確定最佳凍融數(shù)。

1.3.4 正交優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白提取率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)表，對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 蛋白提取率的測定

提取液中蛋白含量的測定采用Bradford法[4]，蛹蟲草粉樣品的蛋白含量測定參照國標(biāo)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法[5]。根據(jù)以下公式計(jì)算提取率：

1.3.6 蛹蟲草蛋白等電點(diǎn)（pI）的測定

等電點(diǎn)的測定參照劉廣建等[6]的方法。

1.3.7 氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[7]中方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖1可知，在pH低于12時(shí)，蛹蟲草蛋白提取率隨pH的上升而升高，其中pH 10~12時(shí)，提取率上升趨勢(shì)明顯，在pH 12時(shí)提取率最高，為32.85%，之后蛋白的提取率有所下降。說明蛹蟲草蛋白質(zhì)大部分是堿溶性蛋白，pH上升使得更多的蛋白質(zhì)溶出；同時(shí)堿液還能破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵尤其是氫鍵，并使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)表面分子帶有相同的電荷，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶出[8]?？紤]pH高于12，會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，因此選取pH 11、11.5、12進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 pH對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖2可見，提取溫度為20℃時(shí)，蛹蟲草蛋白提取率較低，僅為15.55%，溫度為20~40℃時(shí)，蛋白提取率上升趨勢(shì)明顯；溫度為40~50℃時(shí)，提取率升幅減緩，溫度為50℃時(shí)，提取率最高，為27.58%；溫度高于50~70℃時(shí)，提取率幾乎無變化?？梢娫谝欢ㄌ崛囟确秶鷥?nèi)，溫度的升高會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出。因提取溫度為40℃、50℃時(shí)，蛋白提取率變幅不大，從節(jié)省能耗考慮，選取35、40、45℃，進(jìn)行之后的正交試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖3可見，隨著提取時(shí)間的延長，蛹蟲草蛋白提取率先上升后趨穩(wěn)。提取時(shí)間為1 h時(shí)，提取率非常低，說明提取時(shí)間太短，料液無法充分作用，蛋白質(zhì)不易溶出；提取時(shí)間在1~3 h，隨著提取時(shí)間的延長，蛋白提取率快速上升，提取時(shí)間3 h時(shí)，提取率為25.44%?？紤]提取時(shí)間因素的結(jié)果已非常明顯，因此固定提取時(shí)間為3 h，不將提取時(shí)間作為正交優(yōu)化試驗(yàn)因素。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)料（g）液（mL）比為1∶10時(shí)，蛹蟲草蛋白提取率僅有9.76%，之后隨著料液比的上升，蛋白提取率明顯上升；但料液比大于1∶25后，蛋白提取率幾乎不變。故選用料液比1∶20，1∶25、1∶30這3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.5 反復(fù)凍融對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

凍融法主要是利用冷凍過程中形成的胞內(nèi)冰晶在融化時(shí)使細(xì)胞膨脹而破壁，反復(fù)多次從而使得目的產(chǎn)物更多的溶出，屬物理破壁技術(shù)，操作簡便且不破壞有效成分[9]。由圖5可知，-20℃低溫組與-80℃超低溫組的蛹蟲草蛋白提取率都比未經(jīng)凍融有所上升，兩種冷凍溫度相同凍融次數(shù)的蛋白提取率差異不明顯；凍融次數(shù)的增加，兩種冷凍溫度的蛋白提取率都逐步上升，凍融3次、4次時(shí)提取率最高，為25%左右，但兩種冷凍溫度相同凍融次數(shù)，蛋白提取率差異很小。基于簡化操作和節(jié)能考慮，選擇-20℃凍融2次、3次、4次進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖4 料液比對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

圖5 凍融次數(shù)對(duì)蛹蟲草蛋白提取率的影響

2.2 凍融輔助堿提法正交優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、pH、凍融次數(shù)、提取溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)（表1、表2）。

表1 L 9（34）正交試驗(yàn)因素水平

由表2可知，B（pH）因素對(duì)蛹蟲草蛋白提取率影響最大（R值最高）。各因素對(duì)蛹蟲草蛋白提取率影響依序?yàn)锽>A>D>C（即pH>料液比>溫度>凍融次數(shù)），最佳組合為A3B3C2D2，即最適條件為料（g）液（mL）比1∶25，pH 12，凍融3次，提取溫度40℃。因此，試驗(yàn)凍融輔助堿提法提取蛹蟲草蛋白的最佳條件為料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反復(fù)凍融3次，pH 12，提取溫度40℃，提取時(shí)間3 h。驗(yàn)證試驗(yàn)，此條件蛹蟲草蛋白提取率為35.34%。

表2 L 9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 蛹蟲草蛋白等電點(diǎn)

實(shí)際試驗(yàn)過程中，pH很難調(diào)節(jié)到正好預(yù)設(shè)的點(diǎn)，而過多的酸堿調(diào)節(jié)會(huì)影響待測液體體積從而影響各pH下吸光值的比較，因此操作中盡量調(diào)到接近即可。由圖6可知，當(dāng)pH為3.50左右時(shí)，上清液吸光值最低，說明此時(shí)液體中殘存蛋白最少，故pH 3.50為蛹蟲草蛋白的等電點(diǎn)。此pH條件下，4℃沉淀過夜，按最佳條件提取的蛋白離心后調(diào)節(jié)pH至中性，經(jīng)冷凍干燥后得到粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%的蛹蟲草蛋白粉。

圖6 蛹蟲草蛋白等電點(diǎn)

2.4 蛹蟲草蛋白氨基酸組成

蛹蟲草蛋白氨基酸測定結(jié)果見表3。

由表3可知，試驗(yàn)所提蛹蟲草蛋白富含17種氨基酸，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)前三的氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸，分別為6.18%、5.58%、4.02%，與朱麗娜等測定的蛹蟲草氨基酸組成結(jié)果一致[2]。因采用酸水解制樣，酸水解會(huì)破壞色氨酸，因此色氨酸未能檢測到，而其他必需氨基酸種類齊全，且必需氨基酸占氨基酸總量的42.60%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)E/T應(yīng)達(dá)40%的標(biāo)準(zhǔn)[10]。部分氨基酸評(píng)分（AAS）不高是由于此蛋白質(zhì)還僅是粗提物，有待于進(jìn)一步地去雜提純。

表3 蛹蟲草蛋白的氨基酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 小結(jié)與討論

通過單因素試驗(yàn)得到凍融輔助堿提蛹蟲草蛋白的最優(yōu)條件，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化結(jié)果：蛋白提取料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反復(fù)凍融3次，pH 12，提取溫度40℃，提取時(shí)間3 h，蛹蟲草蛋白提取率為35.34%。

氨基酸組成測定結(jié)果，蛹蟲草蛋白氨基酸種類齊全，必需氨基酸占氨基酸總量的42.60%，具有較好的營養(yǎng)價(jià)值。其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量豐富，三者均屬于呈味氨基酸，這一結(jié)果與菇類鮮美的風(fēng)味相符。谷氨酸參與神經(jīng)元的發(fā)育，突觸的形成、維持和可塑性變化，影響學(xué)習(xí)與記憶等高級(jí)認(rèn)知功能[11]。天冬氨酸能改善心肌收縮功能，減少耗氧量，在冠狀動(dòng)脈循環(huán)障礙缺氧時(shí)，保護(hù)心??；同時(shí)也參與鳥氨酸循環(huán)，能促進(jìn)氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強(qiáng)肝臟功能，消除疲勞[12]。亮氨酸可通過促進(jìn)胰島素分泌來降低機(jī)體的血糖含量，對(duì)高原記憶損傷有改善作用[13-14]?？梢娪枷x草蛋白還具有一定的保健價(jià)值，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，可作為一種新型的蛋白資源應(yīng)用于健康食品的研制與開發(fā)。