薩日呼，烏力吉，解秀花，薩礎(chǔ)拉

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110)

蒙藥蘇格木勒-3湯始載于《四部醫(yī)典》[1]，為蒙醫(yī)臨床常用主治失眠方劑，由白豆蔻15 g、香旱芹10 g、蓽茇5 g組成，其味辛，性溫，具有抑赫依作用。目前在臨床廣泛應(yīng)用于治療失眠癥等。課題組前期將蒙藥蘇格木勒-3湯分為水提物與揮發(fā)油部位進行了廣泛地研究。在完成蘇格木勒-3水提物血清藥物化學(xué)研究的過程中筆者發(fā)現(xiàn)，口服蘇格木勒-3水提物后，大鼠血清中檢測到胡椒堿，且在大鼠腦組織中也檢測到了胡椒堿。目前已發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、鎮(zhèn)靜、抗驚厥[4]、抗抑郁[5]等諸多藥理作用。推測胡椒堿為蘇格木勒-3潛在的有效物質(zhì)，但是蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動學(xué)特征尚未明確。因此，為了揭示蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動學(xué)特征，并了解其體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄過程，且為蘇格木勒-3的進一步開發(fā)研究提供科學(xué)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)。為此，本文首先建立胡椒堿的檢測方法，并將該法用于研究給予蘇格木勒-3水提物后大鼠體內(nèi)胡椒堿的藥動學(xué)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 胡椒堿對照品(批號：110775-201706，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；維拉帕米(批號：110788-201707，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；甲醇(批號：CAS67-56-1，含量≥99.9%)、乙腈(批號：LOT190882，含量≥99.9%)均為色譜純(Fisher)；水為純化水，其他試劑均為分析純。

蘇格木勒-3水提物、蓽茇水提物由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實驗中心提供，蘇格木勒-3中各單味藥材：白豆蔻、香旱芹與蓽茇(內(nèi)蒙古天立藥材公司)。經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院圖門巴雅爾教授鑒定：白豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierreexGagnep和爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland.exMaton的果實(產(chǎn)地：廣西，安國路路通中藥飲片有限公司，批號：1606021)；白豆蔻含量符合《中華人民共和國藥典》2015年版的要求；香旱芹為傘形科植物孜然芹CuminumcyminumL.的成熟果實(產(chǎn)地：新疆，安國路路通中藥飲片有限公司，批號：150401)；蓽茇為胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥未成熟或成熟的果穗(產(chǎn)地：湖南，安國路路通中藥飲片有限公司，批號：150401)；蓽茇符合《中華人民共和國藥典》2015年版的要求。

1.1.2儀器 Waters ACQUITY UPLC超高液相系統(tǒng)，Waters Xevo G2-XS Tof[沃特世科技(上海)有限公司]；Biofuge primo R臺式離心機(美國Thermo公司)；Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平(感量：0.001 mg，北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；GENIE微型旋渦混合儀(美國)。

1.1.3實驗動物 健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量220～260 g，由北京海淀區(qū)興隆動物實驗繁殖中心提供，合格證編號：SCXK(蒙)2002-0001，飼養(yǎng)室相對濕度40%～50%，溫度(24±2) ℃，明暗12 h交替環(huán)境中適應(yīng)7 d。

1.2方法

1.2.1色譜條件 液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色譜柱(Waters公司)；流動相甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。A：B=70%：30%。流速：0.4 mL· min-1。柱溫30 ℃，進樣量為：2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源ESI+，正離子模式檢測，多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，胡椒堿母離子m/z286，子離子m/z201，錐孔電壓80 V，碰撞電20 V。維拉帕米母離子m/z455，子離子m/z165，錐孔電壓80 V，碰撞電20 V。毛細管電壓2.98 kV，離子源溫度130 ℃，干燥器溫度449 ℃，干燥氣流速99 L· h-1。

1.2.2對照品儲備液的制備 精密稱取胡椒堿對照品適量，甲醇溶解，配成20.36 μg·mL-1儲備液，置4 ℃冰箱中儲存。

1.2.3內(nèi)標(biāo)物儲備液的制備 精密稱取維拉帕米內(nèi)標(biāo)物適量，甲醇溶解，配成5.08 μg·mL-1的儲備液，置4 ℃冰箱中儲存。

1.2.4血清樣品的預(yù)處理 精密吸取內(nèi)標(biāo)物10 μL于具塞離心管中，加入大鼠血清樣品200 μL，加乙腈800 μL，渦旋5 min，12 000 r· min-1(r=0.25 cm)離心15 min，取上清液于40 ℃氮吹流吹干，殘渣用100 μL流動相溶解，12 000 r· min-1離心15 min，進樣分析。

1.2.5藥動學(xué)實驗

①蘇格木勒-3水提物的制備 稱取備用的蘇格木勒-3湯(白豆蔻：香旱芹：蓽茇=3：2：1)50 g，加純化水1000 mL，煎煮30 min后，濾過，濾液蒸干，蘇格木勒-3得率為：18%。

②藥動學(xué)實驗 取SD大鼠，給藥前禁食不禁水12 h，按臨床劑量40倍給藥灌胃給予蘇格木勒-3水提物3.96 g·kg-1，給藥后10，20，30 min，1，2，4，6，8，12，24 h由大鼠眼底靜脈叢采血約2 mL，3000 r·min-1(r=0.5 cm)離心15 min，分離血清，-80 ℃冷凍儲藏。

2 結(jié)果

2.1專屬性實驗 空白血清、空白血清+胡椒堿、胡椒堿對照品+內(nèi)標(biāo)物+空白血清、給藥后30 min的含藥血清多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。由圖1可知，血清中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾胡椒堿和內(nèi)標(biāo)物的測定。胡椒堿與內(nèi)標(biāo)物的保留時間分別為5.69和2.95 min。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血清，稀釋胡椒堿對照品儲備液，按血清樣品處理方法操作，配制成相當(dāng)于胡椒堿為20.272，10.136，5.068，2.534，1.267，0.633 5，0.032，0.015 μg ·mL-1的血清對照樣品溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以胡椒堿濃度為橫坐標(biāo)，以胡椒堿與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y=0.087 1X+0.005 8，R2=0.999 4，胡椒堿在0.015～20.272 μg·mL-1線性良好。胡椒堿的定量下限為0.015 μg·mL-1

A.PCPA大鼠空白血清加胡椒堿對照品；B.胡椒堿對照品+內(nèi)標(biāo)+空白血清；C.蘇格木勒-3水提物含藥血清樣品；1.維拉帕米；2.胡椒堿。

。

2.3準(zhǔn)確度與精密度考察 取空白血清按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項下的方法分別制備低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)質(zhì)量控制樣品，每個質(zhì)量濃度進行6個樣本分析，連續(xù)測定3 d，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度(RSD)[6]，結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清中胡椒堿準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)實驗結(jié)果

2.4基質(zhì)效應(yīng) 精密加入低、中、高濃度對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，復(fù)溶到100 μL，渦旋3 min，12000 r·min-1(r=0.25 cm)，離心15 min，按“2.1”色譜條件下進行測定，峰面積為A1，按“2.4”項下方法提取空白血清，離心濃縮后同法操作，峰面積為A2，計算基質(zhì)效應(yīng)，公式為基質(zhì)效應(yīng)=A2/ A1×100%，結(jié)果見表1，可知內(nèi)源性物質(zhì)對胡椒堿無影響。

2.5胡椒堿提取回收率 在空白血清中加入已知量的胡椒堿對照品，制成低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的質(zhì)量控制樣品，進行樣品處理，測定。另取空白血清樣品，樣品處理，離心后得上清液，分別加入上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，經(jīng)過處理后測定。以2種方法測得的胡椒堿峰面積比值計算提取回收率，回收率為70% ～85%。

2.6胡椒堿穩(wěn)定性考察 在空白血清中加入已知量的胡椒堿對照品，制成低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的質(zhì)量控制樣品各3樣本，考察樣品在室溫放置24 h、-20 ℃保存30 d，經(jīng)歷3個冷凍-解凍循環(huán)下的穩(wěn)定性[7]，結(jié)果表明胡椒堿在上述條件下均穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

2.7蘇格木勒-3水提物中胡椒堿大鼠血清藥動學(xué)研究 取“1.2.4”項下制備血清樣品，在擬定色譜條件下進樣分析。以血藥濃度對時間作圖，采用藥動學(xué)軟件對胡椒堿在大鼠體內(nèi)的血藥濃度時間曲線進行擬合，結(jié)果見圖2，其主要的藥動學(xué)參數(shù)見表3。

表2 大鼠血清中胡椒堿穩(wěn)定性考察

表3 蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動學(xué)參數(shù)

圖2 大鼠血清中胡椒堿藥物濃度-時間曲線

3 討論

近幾年來，胡椒堿的藥動學(xué)研究報道較多，鐘峰等[8]采用HPLC法測定了大鼠血漿中胡椒堿的血藥濃度并進行了藥動學(xué)研究。當(dāng)HPLC法測定血漿中藥物成分濃度時，缺點在于靈敏度較低，無法測得血藥濃度較低樣品，從而影響了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，本文采用UPLC-Q-TOF法測定了胡椒堿的血藥濃度。實驗比較了胡椒堿在正離子和負離子兩種檢測方式下的響應(yīng)，結(jié)果用負離子檢測時胡椒堿信號響應(yīng)很弱，而采用正離子檢測則信號強度較大，故選擇了在正離子模式下測定。

本文在考察血清樣品處理方法時選用了固相萃取與有機溶劑除去蛋白的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈除蛋白的預(yù)處理效果較好。在選用乙腈除蛋白的方法時，又考察了血清樣品與乙腈比例1：2、1：3、1：4時除蛋白效果，1：4時除蛋白效果最好。

藥動學(xué)研究結(jié)果表明：蘇格木勒-3水提物中胡椒堿在正常大鼠體內(nèi)血藥濃度于4 h內(nèi)才達到峰值，半衰期也較長。下一步，筆者將與蓽茇單藥中胡椒堿的數(shù)據(jù)進行比對。綜上所述，本文揭示了蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動學(xué)特征，為其進一步開發(fā)研究提供了科學(xué)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)。