寇 靜 連莉陽 張宏方 環(huán) 誠 史琳娜 呂蕊花 賀太平

(陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院，咸陽市 712046，電子郵箱:78276628@qq.com)

痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes，PA)是一種生長相對緩慢的典型革蘭陽性厭氧菌，其與皮膚疾病粉刺的形成息息相關，為痤瘡患者毛囊皮脂腺內的優(yōu)勢菌群，被認為是引起痤瘡病變的主要微生物，占所有檢測到微生物數(shù)量的89%[1]。目前認為，微生物參與的致病機制主要與其形成的生物膜相關[2]。當這些病原菌形成生物膜結構時,多糖鈣架多聚體構成一個保護性外骨架，形成一個生物膜微環(huán)境，使得這些病原菌對宿主細胞的致病性和對抗菌藥物的免疫性成倍地增加。PA作為痤瘡病灶中的優(yōu)勢菌群，其成膜能力的強弱對痤瘡的根治、復發(fā)有很大的影響。本課題組前期研究表明，中藥銀黃消痤對痤瘡有一定的治療作用[3]，但其對痤瘡病變中的優(yōu)勢菌群PA生物被膜抑制作用的相關機制，尚缺乏系統(tǒng)的研究報告。本研究探討中藥銀黃消痤抑制PA生物被膜的效果，為臨床治療痤瘡提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 受試菌株 PA均分離自于陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院的痤瘡患者皮損組織，采用剛果紅平板檢測桿菌胞間多糖黏附素合成情況，篩選出強產膜PA實驗株為受試菌株，置于-80℃冰箱保存。

1.2 試劑 中藥銀黃消痤為陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院自制藥劑；TSB培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號：190607)，MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20191202)，剛果紅瓊脂培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司，批號：190719)，腦心浸出液(brian heart infusion，BHI)培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司，批號：20190716)，普通的營養(yǎng)瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司，批號：190718)；結晶紫染料(上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號：760213)。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液的制備：將1.1中分離的菌株接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37℃進行培養(yǎng)48 h，再用TSB培養(yǎng)基于搖床上37℃厭氧培養(yǎng)48 h二次活化，3 500 r/min離心15 min棄上清，無菌生理鹽水洗滌，采用滅菌生理鹽水校正菌懸液濃度為吸光度值600=0.1(約0.5麥氏單位，5×108CFU/mL)[4]。

1.3.2 生長動力學檢測：參照文獻[5]，分別取100 μL配制好的菌懸液接種于含100 μL MH肉湯培養(yǎng)基的96孔板，37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h(每個時間段設6個復孔)后，于酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)590 nm波長處分別測定各孔吸光度值檢測菌液濃度；棄去培養(yǎng)液，采用結晶紫染色法觀察細菌生物被膜形成情況，在590 nm波長處測定吸光度值，作為生物被黏膜附量。

1.3.3 藥品的配制與最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)/最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)的測定：采用96孔微量板二倍稀釋法分別測定中藥銀黃消痤對PA的MIC和MBC。將中藥銀黃消痤采用二倍稀釋法分別配制成終濃度為150 mg/mL、75 mg/mL、37.5 mg/mL、18.75 mg/mL、9.38 mg/mL、4.69 mg/mL、2.34 mg/mL、1.17 mg/mL、0.59 mg/mL、0.29 mg/mL、0.15 mg/mL、0.07 mg/mL的含藥營養(yǎng)肉湯，按照所含藥物濃度從高到低的順序分別依次加入96孔微量板,每孔180 μL，另備2孔各加營養(yǎng)肉湯180 μL。將1.3.1制備的PA菌懸液，分別加入微量板含藥孔以及1孔營養(yǎng)肉湯(對照孔)中,每孔加20 μL菌懸液,以未加菌懸液的營養(yǎng)肉湯孔為空白孔。將微量板置于厭氧密封袋中,加入?yún)捬醢l(fā)生袋,封口,37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)72 h，于酶標儀測定590 nm波長處測吸光度值，其中吸光度值無變化的最小藥物濃度設為MIC。分別取培養(yǎng)后96孔中培養(yǎng)液50 μL涂布在營養(yǎng)瓊脂平板，37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)72 h，無菌落生長為最小殺菌濃度MBC。

1.3.4 中藥銀黃消痤對PA生物膜形成的影響:參照文獻[6]，配制中藥銀黃消痤終濃度分別為1/4 MIC和1/2 MIC、1 MIC、2 MIC的含藥BHI培養(yǎng)基。將96孔細胞培養(yǎng)板分為空白組、對照組和4個銀黃消痤組進行實驗，4個銀黃消痤組加入50 μL痤瘡丙酸桿菌菌懸液后用含相應濃度中藥銀黃消痤的BHI培養(yǎng)基150 μL培養(yǎng)，對照組加入50 μL痤瘡丙酸桿菌菌懸液后用不含藥的BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)，空白組只加入50 μL BHI培養(yǎng)基，不加菌懸液。將96孔板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)板，于酶標儀590 nm波長處讀取吸光度值，計算生物被膜形成抑制率。生物被膜形成抑制率(%)=(吸光度值對照組-吸光度值樣品測定孔)/吸光度值對照組×100%。實驗重復3次。再取24孔板，置入預先泡酸處理的蓋玻片，分為銀黃消痤組和對照組、空白組，按上述方法處理各組后，將24孔板置于37℃厭氧條件下培養(yǎng)72 h，取出玻片，結晶紫染色[7]，顯微鏡下觀察各組生物膜形態(tài)的變化。

1.3.5 中藥銀黃消痤抑制PA黏附的效果：取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔各加入100 μL PA菌懸液，分為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC和2 MIC 4個銀黃消痤組和BHI對照組，4個銀黃消痤組各加入相應濃度的含藥BHI培養(yǎng)基100 μL，對照組加入BHI培養(yǎng)基100 μL，另設置無菌空白組加入BHI培養(yǎng)基200 μL。置于37℃厭氧條件下分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h后，棄去培養(yǎng)基，結晶紫染色，讀取酶標儀590 nm波長處的吸光度值。每個濃度設置3個復孔，實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析 將所有數(shù)據(jù)錄入Microsoft Office Excel 2016軟件中進行整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 生長動力學檢測 隨著培養(yǎng)時間的延長，PA的菌液濃度均呈上升趨勢，而在96孔板中的細菌生物被膜黏附量增長趨勢不明顯。見圖1。

圖1 PA菌液濃度及PA生物膜生長量曲線圖

2.2 中藥銀黃消痤對PA的MIC及MBC 微量二倍稀釋法結果顯示，中藥銀黃消痤對PA的MIC為2.34 mg/mL，MBC為37.5 mg/mL。

2.3 中藥銀黃消痤對PA生物被膜形成的影響 干預72 h后，空白組未見細菌生長。1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組的生物被膜形成抑制率均高于1/4 MIC銀黃消痤組,且2 MIC銀黃消痤組的生物被膜形成抑制率均高于1/2 MIC與1 MIC銀黃消痤組(均P<0.05)，但1/2 MIC銀黃消痤組與1 MIC比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。鏡下可見對照組和1/4 MIC銀黃消痤組菌體邊界模糊且相互重疊，形成團塊，形成了具有獨立單位的典型生物被膜結構，但隨著藥物濃度的增加，菌體逐漸趨于分散狀態(tài)，在2 MIC銀黃消痤組中只有少量細菌粘連，大部分呈散在分布，見圖2。

表1 5組PA生物被膜形成抑制率的比較(x±s)

圖2 5組PA生物被膜形成情況(結晶紫染色，×1000)

2.4 中藥銀黃消痤對PA生物膜黏附作用的影響 干預2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組PA生物被膜黏附作用均低于對照組，且干預4 h后1/4 MIC銀黃消痤組PA生物被膜黏附作用也低于對照組(P<0.05)，但中藥銀黃消痤對PA生物被膜黏附的抑制作用的濃度依賴性不明顯。見表2。

表2 5組PA生物被膜黏附情況的比較(x±s，吸光度值)

3 討 論

細菌生物被膜是由多糖基質、纖維蛋白和脂質蛋白等構成的骨架保護結構，可以對抗外界不利環(huán)境[8]。生物被膜不僅使細菌牢固附著于創(chuàng)面組織,還可以保護細菌免受抗生素、消毒劑和免疫系統(tǒng)的攻擊,導致感染持續(xù)時間長、創(chuàng)面遷延不愈[9]。盡管目前痤瘡的確切病因及發(fā)病機制尚不十分明確，但微生物被認為是其發(fā)病的重要病因之一[10]，而微生物在毛囊中大量繁殖并形成生物被膜結構是痤瘡發(fā)病的關鍵機制。PA為痤瘡患者毛囊皮脂腺內第一優(yōu)勢菌群，與痤瘡的炎癥損害及嚴重程度有著很大關系。

目前，臨床上主要應用抗生素及維A酸類藥物等治療痤瘡，但不良反應較多，且容易出現(xiàn)細菌耐藥性。中藥由“活性成分群”構成，按照一定要求配伍組合，通過多靶點、多途徑發(fā)揮整合調節(jié)作用。有研究顯示，中藥主要是通過調節(jié)人體的免疫系統(tǒng)來對抗病原微生物[11]，在臨床治療中我們亦發(fā)現(xiàn)中藥及中藥復方具有比較強的抗感染作用。近年來，使用中藥及其提取物治療痤瘡得到越來越多的關注，相關的機制研究日益增多[12-14]。中藥銀黃消痤是陜西中醫(yī)藥大學皮膚科院內制劑，其處方以《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》中枇杷清肺飲為基礎加減化裁而成，全方由金銀花、黃芩、枇杷葉、黃連、連翹、野菊花、薏苡仁、白花蛇舌草、丹參等10余味藥物組成,其中金銀花、黃連、黃芩等中藥具有廣譜抗菌、抗炎等作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及部分真菌等均有抑制作用，并能增加巨噬細胞的吞噬功能,減少炎性滲出[15]；白花蛇舌草能刺激體內網狀內皮系統(tǒng)增生，并可增強白細胞的吞噬能力；丹參可活血化瘀，改善微循環(huán)[16]，減輕上皮角化，其有效成分丹參酮可抗炎、抑菌，并可對抗雄激素從而抑制皮脂分泌等。

本課題組前期臨床研究顯示，采用中藥銀黃消痤治療痤瘡患者，總有效率達到92%[3]，本研究結果顯示，干預72 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組的PA生物被膜形成抑制率均高于對照組和1/4 MIC銀黃消痤組(P<0.05)，提示一定濃度的中藥銀黃消痤能夠有效抑制PA生物被膜的形成。且干預2 h、3 h、4 h后，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC銀黃消痤組痤瘡丙酸桿菌黏附作用均低于對照組，干預4 h后1/4 MIC銀黃消痤組黏附作用也低于對照組(P<0.05)，提示中藥銀黃消痤濃度為1/2 MIC時，在干預早期即對PA的黏附作用具有抑制性，即使是使用1/4 MIC的低濃度中藥銀黃消痤，干預4 h后也可抑制PA的黏附作用。

綜上所述，一定濃度的中藥銀黃消痤對臨床分離PA的生長和黏附有較強的抑制作用，這可為臨床用藥治療痤瘡頑疾提供參考。