張躍，孫彥申

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。膀胱癌的生物學(xué)特征較為復(fù)雜，具有多發(fā)灶、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特征。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是膀胱癌病人治療失敗和死亡的主要原因。目前，膀胱癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究其發(fā)病機(jī)制并尋找新的有效治療靶點(diǎn)十分有必要。miR-744-5p是微小RNA（miRNA）家族成員，參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程。劉紅軍等用miRNA 芯片檢測(cè)姜黃素對(duì)膀胱癌細(xì)胞miRNA 表達(dá)圖譜的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，姜黃素可上調(diào)膀胱癌細(xì)胞中miR-744-5p 表達(dá)。然而，miR-744-5p 對(duì)膀胱癌細(xì)胞惡性表型的影響還未知。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-744-5p 可能靶向調(diào)控ILK 表達(dá)。整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的主要信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性表型。研究顯示，膀胱癌組織中ILK 表達(dá)升高，且ILK 高表達(dá)與膀胱癌病理分化程度密切相關(guān)，檢測(cè)ILK 水平有助于膀胱癌的臨床診斷與預(yù)后，沉默ILK 基因表達(dá)可阻礙膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。本研究主要探討了miR-744-5p 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響以及其是否通過(guò)調(diào)控ILK表達(dá)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取2016 年2 月至2018 年11 月本院接收的56 例經(jīng)病理切片確診的膀胱癌病人的癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織。其中男性31 例，女性25例，年齡36～71 歲，平均年齡（52.29±6.71）歲。所有病人均未接受任何治療，如放療、化療等。病人或其近親屬知曉本研究，并簽署知情同意書(shū)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑

膀胱癌BIU-87、T739 細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（FBS），杭州四季青；RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國(guó) Hyclone 公司；Lipofectamine2000 試劑盒，美國(guó) Invitrogen 公司；四氮唑藍(lán)（MTT），美國(guó) Sigma 公司；miR-744-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-744-5p、anti-miR-NC、ILK 的小干擾RNA（si-ILK）及陰性對(duì)照si-NC、ILK 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-ILK）及空載體pcDNA3.1，上海吉瑪公司；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物；鼠抗人細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）、P21、ILK單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz 公司；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）和鈣黏附蛋白E（E-cadherin）單克隆抗體，福州邁新生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1

細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇BIU-87、T739 細(xì)胞，均用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期BIU-87、T739細(xì)胞，均接種于6孔板中（1.0×10個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h 后，更換為不含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。利用LiPofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將miR-744-5p mimcs（miR-744-5p 組）、anti-miR-744-5p（anti-miR-744-5p 組）、si-ILK（si-ILK 組）、miR-NC（miR-NC 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、si-NC（si-NC 組）、miR-744-5p mimcs 與 pcDNA3.1-ILK（miR-744-5p+pcDNA-ILK 組）、miR-744-5p mimcs 與pcDNA3.1（miR-744-5p+pcDNA 組）分別轉(zhuǎn)染至BIU-87、T739 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h 后，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中miR-744-5p、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)細(xì)胞中ILK 蛋白表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2

qRT-PCR 檢測(cè) miR-744-5p 表達(dá) 用 Trizol試劑提取組織或細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，行PCR擴(kuò)增。引物序列miR-744-5p正向5′-CTGTTGCCACTAACCTCAACCT-3′，反向 5′-TGCGGGGCTAGGGCTAACAGCA-3′；U6 正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向 5′-A ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′。用2法計(jì)算組織或細(xì)胞中miR-744-5p相對(duì)U6的表達(dá)量。

1.3.3

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將各組轉(zhuǎn)染后的BIU-87、T739 細(xì)胞均接種于96 孔板中（1.0×10個(gè)/孔），培養(yǎng)24、48、72 h 后，加 20 μL MTT（5 g/L）。孵育 4 h 后，棄培養(yǎng)基，加150 μL 二甲基亞砜，混合均勻，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4

Transwell 實(shí)驗(yàn) 將各組轉(zhuǎn)染后的BIU-87、T739細(xì)胞用不含不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整密度為2.5×10個(gè)/mL。遷移實(shí)驗(yàn)：取100μL 細(xì)胞懸液加至 Transwell 上室，500μL 含 10 %FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，取出小室，用甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，用顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在Transwell 上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后，再加100μL細(xì)胞懸液，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.5

Western Blotting 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組轉(zhuǎn)染后的 BIU-87 細(xì)胞均接種于 6 孔板中（1.0×10個(gè)/孔），培養(yǎng)48 h 后，用RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度。然后行12%SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜及5%脫脂牛奶中封閉1 h 后，在4 ℃并箱中分別 用 Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶500）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 GAPDH 一抗孵育過(guò)夜。洗膜后，再于37 ℃搖床中用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。加入顯影液，避光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對(duì)GAPDH的表達(dá)量。

1.3.6

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)miR-744-5p 與 ILK 的 3’UTR 序列的結(jié)合位點(diǎn)，合成 ILK 目的基因；同時(shí)將結(jié)合位點(diǎn)突變，合成ILK 突變基因。以pGL3 為載體，Xho I 和 Kpn I 為插入位點(diǎn)，獲得 ILK基因野生型質(zhì)粒WT-ILK 及突變型質(zhì)粒MUT-ILK。取對(duì)數(shù)期 BIU-87、T739 細(xì)胞接種于24 孔板中（2.5×10個(gè)/孔），培養(yǎng) 24 h 后，棄培養(yǎng)基。利用 Lipofectamine2000 試 劑 盒 ，將 WT-ILK 與 miR-744-5p mimics 或 miR-NC、MUT-ILK 與 miR-744-5p mimics或miR-NC+ pGL3-MUT-ILK 分別共轉(zhuǎn)染至BIU-87、T739 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換新鮮的培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞，離心（3 500 r/min、5 min）后，取上清液，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)與海腎的熒光強(qiáng)度比較表示。

2 結(jié)果

2.1 miR

-

744

-

5p 在癌旁組織和膀胱癌組織中的表達(dá)

癌旁組織、膀胱癌組織中miR-744-5p 的表達(dá)水平分別為（0.98±0.10）、（0.25±0.02），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=21.475，

P

＜0.05）。

2.2 過(guò)表達(dá)miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表達(dá)對(duì)BIU

-

87、T739細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-744-5p mimics 的 BIU-87 細(xì) 胞中 miR-744-5p 表 達(dá) 水平分別為（1.09±0.11）、（3.11±0.31），T739 細(xì)胞中miR-744-5p 表達(dá)水平分別為（1.02±0.10）、（2.56±0.26），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=18.423，

P

＜0.05；

t

=16.585，

P

＜0.05），表明 miR-744-5p mimics 轉(zhuǎn)染成功，過(guò)表達(dá) miR-744-5p 的 BIU-87、T739 細(xì)胞構(gòu)建成功。miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細(xì)胞 OD 值和Cyclin D1 蛋白表達(dá)低于miR-NC 組（

P

＜0.05），而P21蛋白表達(dá)高于 miR-NC 組（

P

＜0.05）。見(jiàn)圖 1，表1，表2。

表1 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖的影響/

表2 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞增殖的影響/

圖1 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87、T739細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響：A為過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響；B為過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

轉(zhuǎn) 染 anti-miR-NC、anti-miR-744-5p mimics 的BIU-87 細(xì)胞中 miR-744-5p 表達(dá)水平分別為（1.03±0.10）、（0.35±0.03），T739 細(xì)胞中 miR-744-5p 表達(dá)水平分別為（1.01±0.11）、（0.31±0.04），兩者比較差異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（

t

=19.540，

P

＜0.05；

t

=17.942，

P

＜0.05），表明 anti-miR-744-5p 轉(zhuǎn)染成功，抑制 miR-744-5p 的 BIU-87、T739 細(xì)胞構(gòu)建成功。anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細(xì) 胞 細(xì) 胞 OD 值 高 于 antimiR-NC組（

P

＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 抑制miR-744-5p對(duì)BIU-87、T739細(xì)胞增殖的影響/

2.3 過(guò)表達(dá)miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表達(dá)對(duì)BIU

-

87、T739 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

miR-744-5p組 BIU-87、T739 細(xì)胞的遷移數(shù)、侵襲數(shù)和 MMP-2 蛋白表達(dá)低于miR-NC 組（

P

＜0.05），而E-cadherin 蛋白表達(dá)高于miR-NC組（

P

＜0.05）。見(jiàn)圖2，表4，表5。

表4 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞遷移和侵襲的影響/

表5 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞遷移和侵襲的影響/

圖2 過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87、T739細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響：A為過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞遷移和侵襲蛋白表達(dá)的影響；B為過(guò)表達(dá)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞遷移和侵襲蛋白表達(dá)的影響

anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)升高于anti-miR-NC組（

P

＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 抑制miR-744-5p對(duì)BIU-87、T739細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

2.4 miR

-

744

-

5p 靶向調(diào)控ILK 的表達(dá)

生物信息學(xué)軟件顯示的 ILK 的 3’UTR 與 miR-744-5p 的互補(bǔ)序列見(jiàn)圖3A。共轉(zhuǎn)染miR-744-5p 與WT-ILK 的BIU-87、T739 細(xì)胞熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染miRNC 與 WT-ILK 的 BIU-87、T739 細(xì)胞（

P

＜0.05），而共轉(zhuǎn)染 miR-744-5p 與 MUT-ILK 的 BIU-87、T739 細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC 與MUT-ILK 的BIU-87、T739 細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miR-744-5p 在 BIU-87、T739 細(xì)胞中可與 ILK 的 3’UTR 靶向結(jié)合。與 miR-NC 組相比，miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細(xì)胞 ILK 蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）；antimiR-NC 組相比，anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細(xì)胞ILK 蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），說(shuō)明miR-744-5p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控ILK。見(jiàn)圖3，表7，表8。

表7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/

表8 miR-744-5p調(diào)控BIU-87、T739細(xì)胞中ILK蛋白表達(dá)/

圖3 miR-744-5p靶向調(diào)控ILK：A為ILK的3’UTR含有miR-744-5p的互補(bǔ)序列；B為miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞ILK蛋白表達(dá)的影響；C為miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞ILK蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)ILK 逆轉(zhuǎn)了miR

-

744

-

5p 對(duì)BIU

-

87、T739 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-744-5p+pcDNA3.1-ILK 組 BIU-87、T739 細(xì)胞 OD 值、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及Cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達(dá)高于miR-744-5p+pcDNA3.1 組（

P

＜0.05），但 P21 和 E-cadherin蛋白表達(dá)低于miR-744-5p+pcDNA3.1 組（

P

＜0.05）。見(jiàn)圖4，表9～12。

圖4 過(guò)表達(dá)ILK能逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)BIU-87、T739細(xì)胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響：A為過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲蛋白表達(dá)的影響；B為過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞增殖、遷移和侵襲蛋白表達(dá)的影響

表9 過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞增殖的影響/

表10 過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞增殖的影響/

表11 過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)BIU-87細(xì)胞遷移和侵襲的影響/

表12 過(guò)表達(dá)ILK逆轉(zhuǎn)miR-744-5p對(duì)T739細(xì)胞遷移和侵襲的影響/

3 討論

miRNA 是一類小分子單鏈非編碼RNA，其可通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，miR-744-5p 在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，通過(guò)直接靶向HNRNPC 和NFIX 誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。miR-744-5p 參與調(diào)節(jié)乳腺浸潤(rùn)性微乳頭狀癌（IMPC）對(duì)紫杉醇的耐藥性，可作為IMPC 的分子標(biāo)志物。高表達(dá)miR-744-5p 可通過(guò)靶向抑制UBE2L3 的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，遷移，侵襲等惡性表型，其在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。目前，miR-744-5p 對(duì)膀胱癌的影響還未知。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中miR-744-5p 呈低表達(dá)，膀胱癌 BIU-87、T739 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-744-5p mimics 后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，而轉(zhuǎn)染miR-744-5p 抑制劑后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力提高，表明miR-744-5p 在膀胱癌組織中活性喪失，恢復(fù)癌細(xì)胞中miR-744-5p 表達(dá)可降低癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，提示miR-744-5p作為抑癌基因參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展，其活性喪失可能是導(dǎo)致膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的因素之一，有希望成為膀胱癌治療的分子靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探究miR-744-5p 抑制膀胱癌細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了miR-744-5p 可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控ILK。ILK 是細(xì)胞內(nèi)具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的信號(hào)蛋白，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，沉默ILK 表達(dá)可抑制胰腺癌、人舌癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而過(guò)表達(dá)ILK 可促進(jìn)胃癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。這說(shuō)明ILK 可能在不同腫瘤中發(fā)揮的作用。膀胱癌組織中ILK 表達(dá)升高，聯(lián)合檢測(cè)ILK 與AKT、β-catenin 有助于判斷膀胱癌的惡性程度。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ILK 可有效降低過(guò)表達(dá)miR-744-5p 對(duì)膀胱癌 BIU-87、T739 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這進(jìn)一步提示miR-744-5p 可能通過(guò)靶向抑制ILK 的表達(dá)來(lái)阻礙膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。