歐雋瀅，江楷煜，高瑜悅，張延杰，黃才歡

（1.暨南大學食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）（2.暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州 510632）（3.中山洪力健康食品產業(yè)研究院有限公司，廣東中山 528430）

熱加工是食品制作的一種主要加工方式，但過度熱加工不僅破壞營養(yǎng)素，而且產生有害物質，如5-羥甲基糠醛（HMF）、丙烯酰胺、雜環(huán)胺、氯丙醇、活潑羰基化合物、晚期糖基化終末產物（AGEs）等[1-5]。食品添加劑是為改善食品品質和色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質。基于安全考慮，食品添加劑對有害物質形成的影響近年報道較多。研究發(fā)現，食鹽影響油脂產生氯丙醇：當添加量較低時，隨著其濃度的增加，氯丙醇形成量增加；進一步增加氯化鈉濃度，氯丙醇反而下降。在油酸甘油酯、豬油和雞油的模擬反應體系中，食鹽促進氯丙醇生成的最有效劑量分別是7.00%、20.00%和10.00%[6,7]?；顫婔驶衔锶缫叶?、丙酮醛是丙烯酰胺和晚期糖基化終末產物（AGEs）形成的前體，膨松劑碳酸氫銨促進面包、曲奇等焙烤食品中乙二醛和丙酮醛的形成[8]，并顯著增加丙烯酰胺含量：當面包中碳酸氫銨添加量分別為0.40和1.60 g/100.00 g時，丙烯酰胺含量分別增加17.00和88.00倍[9]。碳酸氫鈉同樣促進丙烯酰胺的形成。在擠壓膨化食品中（含水量22.00%～26.00%），添加0.10 g/100.00 g的碳酸氫鈉使丙烯酰胺含量增加2.00～3.50倍[10]。

鑒于一些食品添加劑可能產生負面作用，國家對食品添加劑的管理越來越嚴格。如2014年，國家衛(wèi)生計生委等5部門聯合印發(fā)的《關于調整含鋁食品添加劑使用規(guī)定的公告》，限制了硫酸鉀鋁、硫酸鋁銨等膨松劑的應用范圍。主要原因是長期攝入鋁會對人體產生慢性毒作用，包括神經毒性、生殖毒性和肝臟毒性[11]，影響人的神經系統和人的腦細胞等代謝，以及兒童生長和智力發(fā)育[12]。但是，基于食品添加劑影響有害物質形成而被限制使用的例子在國內還不多見。但歐洲要求更為嚴格，如歐洲食品安全局經過10多年的評估，2017年出臺了食品中丙烯酰胺控制法規(guī)（Commission Regulation (EU) 2017/2158），要求食品企業(yè)減少碳酸氫銨等膨松劑用量或采用其替代品[13]。

5-羥甲基糠醛（HMF）是熱加工食品中含量較高的一種內源有害物，廣泛存在于焙烤食品、干果和焦糖制品中[1,14]。高劑量的HMF對人體橫紋肌、內臟、基因和神經等具有毒副作用，對皮膚、眼睛、上呼吸道及粘膜具有刺激和損傷作用，并通過醛基與人體蛋白（DNA）的氨基或巰基反應，影響細胞功能和生長，影響正常代謝[15,16]。但低劑量的HMF卻具有抗氧化、抗腫瘤細胞增殖、改善血液流變學、抗心肌缺血、調節(jié)Ca2+平衡、抗酪氨酸酶等生物活性[15]。10年前Monien等發(fā)現，磺基轉移酶可將HMF轉化為具有致癌活性和基因毒性的5-亞磺酰甲基糠醛[17]，該酶廣泛存在于人和動物體內。因此，攝入高劑量的HMF可能導致人體產生各種癌變，如肝癌、結腸癌等[18]。2015年歐洲食品安全局正式確認了5-亞磺酰甲基糠醛的致癌活性[19]。因此，近年來，食品中HMF的安全性問題成為國際研究熱點。

焙烤、油炸、膨化等高溫加工食品因其食用量大，HMF含量高而成為人體HMF的重要來源。目前人們對HMF的形成途徑已基本清楚，主要來自己糖脫水，或丙酮醛和甘油醛通過羥醛縮合反應后產生HMF[20]。其形成受糖類、加工溫度、pH、水分活度、二價或三價陽離子以及酚類物質等的影響[20]，但有關食品?化劑等添加物的影響鮮見報道。

碳酸氫銨、碳酸氫鈉是焙烤、膨化食品中常用的膨松劑；食鹽可使面筋質地變細密，增強面筋的立體網狀結構，易于擴展延伸，并作為咸味劑而廣泛添加到面團中[21]。因此，本研究以焙烤、膨化食品的主要內源化學污染物HMF為對象，采用形成HMF的不同前體物質（葡萄糖、果糖和蔗糖）構建模擬反應體系，考察膨松劑碳酸氫銨和碳酸氫鈉、食鹽對HMF形成的影響，并以餅干為代表在食品中進行驗證。硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨過去一直作為膨松劑允許在小麥粉及其制品、蝦味片、焙烤食品、膨化食品等（GB2760-2011）或焙烤食品、油炸面制品、面糊、蝦味片等（GB2760-2014）食品中使用[22,23]，但國家衛(wèi)生計生委等5部門聯合印發(fā)的《關于調整含鋁食品添加劑使用規(guī)定的公告》（2014年第8號）已禁止其在小麥粉及其制品（除油炸面制品、面糊、裹粉、煎炸粉外）中使用。為了進一步評價這兩種含鋁膨松劑的負面效果，為國家的規(guī)定提供更多依據，本研究一并將其納入進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低筋面粉（五得利面粉集團有限公司）、起酥油，購于廣州市暨南大學興安超市；葡萄糖、果糖、蔗糖、甘氨酸、食鹽、碳酸氫鈉、碳酸氫銨、硫酸鋁鉀、硫酸鋁銨，分析純，百靈威科技有限公司；羥甲基糠醛（HMF），99%純度，百靈威科技有限公司；甲醇，色譜純，Mallinckrodt Baker公司；不銹鋼試管（25.00 mL）為實驗室定制品。

LC-20AT高效液相色譜儀（配備SPD-M20A光電二極管陣列檢測器），日本島津有限公司；磁力加熱攪拌器（DF-Ⅱ型集熱式），江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；離心機（KDC-12），安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 5種添加物對不同前體物質形成HMF的影響

按照Zhang等的方法設置4個模擬反應體系[24]：葡萄糖/甘氨酸（美拉德反應體系）、葡萄糖、果糖、蔗糖（各成分濃度均為1.00 mM），研究不同濃度的碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽（2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/mL），以及硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL）對HMF形成的影響。將總體積為5.00 mL的反應混合物置于不銹鋼試管中，在160 ℃油浴中反應15 min，冰水浴冷卻后用去離子水定容至10.00 mL，經0.45 μm水相微孔濾膜過濾，采用HPLC法測定HMF含量[25]。

HPLC色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-Aq（4.60×250.00 mm, 5.00 μm），流動相為甲醇-水（5:95，V/V），0.60 mL/min流速等度洗脫40 min，檢測波長284 nm，柱溫40 ℃，進樣量10.00 μL。并以去離子水配制6.25～100.00 mg/L的HMF系列標準溶液，制作標準曲線，外標法定量。

1.2.2 五種添加物對餅干中HMF形成的影響

餅干制作：參考Van Der Fels-Klerx等[26]的方法制作餅干。面團配方：小麥面粉80.00 g，精煉棕櫚油20.00 g，蔗糖35.00 g，水17.60 g。碳酸氫鈉、碳酸氫銨、食鹽、硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨的添加量見表1。首先在不銹鋼盆中將蔗糖和添加物用水分別溶解，再與起酥油充分混合，加入面粉和剩余水制成面團，用壓面機壓面5次后，切成3.00 cm×5.00 cm×0.30 cm形狀面餅片，190 ℃烘烤10 min后，將餅干取出置于干燥器中冷卻。根據Zou等的方法[27]提取餅干中的HMF。取5.00 g餅干粉末，用20.00 mL 80%甲醇水溶液連續(xù)超聲強化提取。每次提取30 min，樣品液在3000.00 g下離心20 min，收集上清液；對沉淀進行第二次提取，重復三次后，合并上清液。在60 ℃下減壓濃縮，除去水和甲醇，得殘留物；加入2.00 mL蒸餾水溶解殘留物，用0.45 μm濾膜過濾，按1.2.1中的方法，采用HPLC法檢測HMF含量。

表1 餅干配方Table 1 Biscuit formulations

1.2.3 餅干水提液pH的測定

按Huang等[28]的方法獲得餅干水提液。稱取1.00 g餅干粉末于離心管中，加入5.00 mL水，超聲提取20 min，3000.00 g離心20 min，取上清液，再加2.00 mL水重復提取2次，合并上清液，用pH計測定提取液樣品的pH。

1.3 數據處理

以上各項測試均重復3次，采用SPSS 17.0軟件系統進行統計學分析，實驗數據以平均數±SD表示。在5.00%水平下，采用Duncan多重比較分析處理間顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 碳酸氫鈉對模擬反應體系中HMF形成的影響

由圖1可知，在美拉德和果糖反應體系中，碳酸氫鈉顯著抑制HMF形成，添加量為2.00 mg/mL時，體系中的的HMF的生成量分別為5.01、3.02 mg/L，與對照組相比分別下降3.06和8.68倍；隨著添加量的增大，HMF生成量進一步降低。其原因可能是由于碳酸氫鈉的水解，提高了體系的pH，不利于美拉德反應中間體薛夫堿的形成和3-脫氧奧蘇糖脫水轉化為HMF[29]。同時，碳酸氫鈉的鈉離子可能和鉀離子相似，抑制HMF形成[21]。對于果糖體系，呋喃果糖陽離子是產生HMF的關鍵步驟，酸性條件下有利于其形成，而堿性的碳酸氫鈉則抑制了呋喃果糖陽離子的產生，從而導致HMF含量下降。

在葡萄糖體系中，隨著碳酸氫鈉添加量的增加，HMF的生成量增加。碳酸氫鈉添加量為6.00 mg/mL時HMF達到最高值17.23 mg/L，為對照（無添加物）的3.31倍。進一步增加碳酸氫鈉添加量，HMF含量開始下降。當碳酸氫鈉添加量為10.00 mg/mL時，HMF形成量與對照相當（圖1）。其原因可能是在弱堿性環(huán)境下，有利于葡萄糖異構化為果糖，而果糖形成HMF的能力顯著高于葡萄糖[21]。如前所述，如果碳酸氫鈉添加過量，則使pH增高，從而抑制呋喃果糖陽離子的形成和3-脫氧奧蘇糖的脫水，導致HMF形成下降。而蔗糖的水解需要在酸性條件下才能進行，堿性的碳酸氫鈉不能促進蔗糖水解為果糖和葡萄糖，因而碳酸氫鈉對蔗糖形成HMF無影響（圖1）。

圖1 碳酸氫鈉對4個模擬反應體系中HMF形成的影響Fig.1 Effects of sodium bicarbonate on HMF formation in four model reaction systems

2.2 碳酸氫銨對模擬反應體系中HMF形成的影響

與無添加物的對照組相比，碳酸氫銨降低所有模擬反應體系中HMF含量（圖2）。當添加量為2.00 mg/mL時，碳酸氫銨在美拉德、葡萄糖和果糖反應體系中都顯著抑制HMF形成，HMF含量分別3.30、1.61和17.52 mg/L，下降4.64、3.28和1.49倍。碳酸氫銨對果糖體系中HMF的抑制效果呈劑量效應。但在美拉德和葡萄糖反應體系中，添加量為4.00～6.00 mg/mL時，碳酸氫銨會略微促進HMF形成（與2.00 mg/mL的添加量相比），而后含量下降。蔗糖體系中形成的HMF量很低，碳酸氫銨抑制其形成（圖2）。碳酸氫銨水解后呈弱堿性，有利于葡萄糖烯醇化進而轉化為果糖，促進HMF形成；但是，NH4+對HMF形成的抑制效果[29]可能發(fā)揮了主要作用，從而導致美拉德反應、葡萄糖和果糖模擬反應體系中的HMF含量下降。

圖2 碳酸氫氨對4個模擬反應體系中HMF形成的影響Fig.2 Effects of ammonium bicarbonate on HMF formation in four model reaction systems

2.3 食鹽對模擬反應體系中HMF形成的影響

由圖3可知，在美拉德、葡萄糖與果糖反應體系中，食鹽的添加均抑制HMF的生成，且呈劑量依賴關系。當添加量為4.0 mg/mL時，HMF生成量分別為7.21、1.52和9.03 mg/L，分別比對照組下降52.88%、70.77%和65.40%。在蔗糖體系中，其pH值趨于中性，酸水解難以發(fā)生，因此該體系中HMF的生成量是四個體系中最低的（圖3）。以上結果表明，食鹽在焙烤食品中除改善口感和面團結構外，還具有抑制HMF形成的作用。

圖3 食鹽對4個模擬反應體系中HMF形成的影響Fig.3 Effects of table salt on HMF formation in four model reaction systems

2.4 鋁鹽對模擬反應體系中HMF形成的影響

由圖4可知，硫酸鋁鉀在4個模擬反應體系中均顯著促進HMF形成。在蔗糖模擬體系中，硫酸鋁鉀的促進效果最明顯，且呈劑量效應；當添加量達到1.00 mg/mL時，HMF形成量為348.30 mg/L，是對照組的696.60倍。在其它3個反應體系中（美拉德、葡萄糖和果糖反應體系），HMF形成量在硫酸鋁鉀添加量為0.60 mg/mL時達到峰值，分別為80.52、13.00和265.03 mg/L，是對照組的5.26、2.50和10.15倍。硫酸鋁銨也顯著促進HMF的形成，且對蔗糖形成HMF的促進效應最強。當添加量為1.00 mg/mL時，HMF形成量是161.41 mg/L，是對照組的322.82倍。在其它3個反應體系中（美拉德、葡萄糖和果糖反應體系），HMF在硫酸鋁銨添加量為0.60 mg/mL時達到峰值，分別為50.92、9.94和139.31 mg/L，是對照組的3.33、1.91和5.34倍。

圖4 硫酸鋁鉀（a）和硫酸鋁銨（b）對4個模擬反應體系中HMF形成的影響Fig.3 Effects of potassium aluminium sulphate (top) and ammonium aluminium sulphate on HMF formation in four model reaction systems

與碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組比較，硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨大幅增加HMF生成量。在最低劑量組（2.00/0.20 mg/mL），硫酸鋁鉀處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽的4.22、6.39、2.05倍（美拉德反應體系），1.24、4.19、1.31倍（葡萄糖反應體系），29.00、4.97、8.13倍（果糖反應體系），300.60、250.50、250.50倍（蔗糖反應體系）。在最高劑量組（10.00/1.00 mg/mL），硫酸鋁鉀處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的46.55、11.64、14.22倍（美拉德反應體系），2.21、3.88、2.58倍（葡萄糖反應體系），64.28、48.70、27.71倍（果糖反應體系），696.60、1161.00、248.79倍（蔗糖反應體系）。在最低劑量組，硫酸鋁銨處理組的HMF含量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的3.34、5.06、1.62倍（美拉德反應體系），1.00、3.38、1.06倍（葡萄糖反應體系），14.47、2.48、4.06倍（果糖反應體系），90.00、75.00、75.00倍（蔗糖反應體系）。在最高劑量組，硫酸鋁銨處理組的HMF量分別是碳酸氫鈉、碳酸氫銨和食鹽處理組的22.18、5.55、6.78倍（美拉德反應體系），1.50、2.63、1.75倍（葡萄糖反應體系），38.96、29.52、16.79倍（果糖反應體系），322.80、538.00、115.29倍（蔗糖反應體系）。

硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨對HMF的促進機理可能源于兩方面。一是它們都為強酸弱堿鹽，水解后pH降低，而較低pH有利于HMF的形成且促進蔗糖在高溫下水解[20]。二是Al3+的催化效果。由于三價陽離子鋁比二價陽離子鈣、鎂對HMF的催化效率更高[20]，因此Al3+的催化可能發(fā)揮更重要的作用。硫酸鋁銨對HMF形成的促進效應小于硫酸鋁鉀，主要原因可能是NH4+對HMF形成的抑制作用[30]。

2.5 五種添加物對餅干中HMF形成的影響

圖5 的結果表明，與無添加物的對照相比，食鹽、碳酸氫銨和碳酸氫鈉處理組的HMF含量都降低。其中，1.00g食鹽+0.40 g碳酸氫銨與1.00 g食鹽+0.80 g碳酸氫銨+0.80 g碳酸氫鈉的處理降低最多，其含量分別為0.88和0.86 mg/kg，分別下降35.34%和33.83%。在硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨處理組中，盡管添加了對HMF具有抑制效果的食鹽、碳酸氫銨和碳酸氫鈉，HMF含量還是大幅升高。當硫酸鋁鉀添加量為0.05 g和0.10 g時，HMF含量分別2.11和2.16 mg/kg，增加58.65%和62.41%。在低添加劑量下（0.05 g），硫酸鋁銨僅略微增加HMF含量，但高劑量（0.10 g）下HMF含量增加了55.64%。因此，從HMF形成角度看，限制含鋁膨松劑在食品中的使用非常合理。添加0.10 g硫酸鋁鉀與硫酸鋁銨后，餅干水提液的pH從9.60下降至6.50左右，pH的降低促進了己糖直接脫水形成HMF[20]。不過，鋁鹽中三價鋁離子的催化效應可能是鋁鹽促進HMF形成的主要原因。研究表明，樣品中的HMF 含量與配方有著重要的關系，由于不同的膨松劑的使用，使食品體系的pH值有著明顯的差異，從而影響HMF 的含量。Kukurova′證實，若用碳酸氫銨（1.00 g/80.00 g面粉）作為膨松劑制作曲奇時，體系的pH值約在7.82，其HMF含量在焙烤過程中出現明顯上升；若只采用碳酸氫鈉（2.00 g/80.00 g面粉）作為膨松劑時，可使食品中HMF的含量從2.96 mg/kg降至1.30 mg/kg，降低了56.08%；主要是因為碳酸氫鈉可使體系的pH控制在8.10～10.00，從而抑制蔗糖形成呋喃果糖陽離子和3-脫氧奧蘇糖[31]；但碳酸氫鈉添加過多會使制品中堿味較大[32]。

圖5 五種添加物對餅干中HMF形成的影響Fig.5 Effect of five additives on HMF formation in biscuits

3 結論

探討添加物對食品有害物形成的影響是目前國內外的研究熱點。本研究發(fā)現，焙烤食品的添加物食鹽和膨松劑碳酸氫鈉、碳酸氫銨在模擬反應體系中能顯著降低HMF含量，當碳酸氫鈉添加量為2.00 mg/mL時，美拉德（葡萄糖/甘氨酸）和果糖反應體系中HMF的生成量分別為5.01、3.02 mg/L，較對照組下降3.06和8.68倍；加入相同量的碳酸氫銨時，美拉德、葡萄糖和果糖反應體系中HMF含量分別為3.30、1.61和17.52 mg/L，分別比對照組下降4.64、3.28和1.49倍；當食鹽添加量為4.00 mg/mL時，HMF生成量分別為7.21、1.52和9.03 mg/L，降幅達52.88%、70.77%和65.40%。而被禁用的膨松劑硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨，則顯著增加HMF含量，最高可達310.13和139.31 mg/L，增幅達620.26和197.00倍。該結果在餅干中得到驗證：添加食鹽、碳酸氫鈉和碳酸氫銨降低餅干中HMF含量，濃度在0.86～0.88 mg/kg之間，降幅為33.83%～35.34%。但是，即使在添加了食鹽、碳酸氫鈉和碳酸氫銨的情況下，硫酸鋁鉀和硫酸鋁銨仍使餅干中HMF含量為2.11和2.16 mg/kg，增幅為58.65%和62.41%。由于HMF在體內可轉化為致癌物質5-亞磺酰甲基糠醛，而焙烤、油炸食品食用量大，HMF含量高而成為人體HMF的重要來源，本研究結果進一步支持了國家限制含鋁膨松劑使用的合法性。